前列腺素E2受體EP3在高血壓腎病中的作用及其對(duì)鈣離子濃度的影響.pdf

1、研究背景：近年來研究發(fā)現(xiàn)高血壓及高血壓腎病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，目前減輕高血壓已被列入終末期腎病治療的主要方法。腎素.血管緊張素.醛固酮(RAAS)系統(tǒng)是人體血壓調(diào)節(jié)的主要系統(tǒng)，在慢性腎損傷特別是高血壓腎臟損傷中有著極為重要的作用和意義。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)作為RASS系統(tǒng)中的重要活性介質(zhì)，不僅通過產(chǎn)生血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)調(diào)節(jié)血壓，同時(shí)在腎臟病領(lǐng)域中，也發(fā)揮著重要的致病作用。AngⅡ主要通過與兩類G蛋白偶聯(lián)受體AT1及AT2結(jié)合，激

2、活不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來發(fā)揮其不同的藥理學(xué)作用。在此兩種受體中，AT1受體介導(dǎo)AngⅡ的主要功能，該受體激活后可以誘發(fā)一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的激活，如增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，以及激活細(xì)胞質(zhì)磷脂酶A2(cPLA2)，有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，蛋白激酶C(PKC)等，而這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)前列腺素的合成有著至關(guān)重要的作用。更有研究顯示，抑制一個(gè)或多個(gè)前列腺素受體的活性可以有效的治療高血壓，至少有一種前列腺素E2受體在RAAS系統(tǒng)調(diào)節(jié)血壓的過程

3、中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。
　　 前列腺素(PGs)是由二十碳不飽和脂肪酸-花生四烯酸氧化代謝產(chǎn)生的，是重要的血管調(diào)節(jié)因子。目前已發(fā)現(xiàn)的具有生物活性的前列腺素家族共有五類，其中前列腺素E2(PGE2)是最主要的前列腺素化合物，其G蛋白偶聯(lián)受體根據(jù)基因編碼的不同分為四種不同的亞型，分別為EP1，EP2，EP3，EP4。前列腺素E2可以通過與不同的受體結(jié)合，激活不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮其不同的生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)全身以及腎臟的血流，調(diào)

4、控。腎臟水鹽代謝及其它的功能。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了EP1，EP2，EP4受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，而EP3受體因?yàn)橛兄喾N不同的剪接亞型，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑并不十分清楚。然而在PGE2的四種受體中，前列腺素E2卻與EP3受體的配體結(jié)合力最強(qiáng)，且EP3受體廣泛表達(dá)于全身各種組織中，特別是在腎臟，胰腺和子宮高表達(dá)。因此，研究發(fā)現(xiàn)EP3受體在機(jī)體中的生物學(xué)作用，以及進(jìn)一步探討其作用的病理生理機(jī)制已經(jīng)成為新的科學(xué)研究方向。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^在兩組基

5、因型不同的小鼠(野生型及EP3基因敲除型)上建立高血壓腎病小鼠模型，驗(yàn)證新型動(dòng)物模型的可行性，并通過該模型的建立，監(jiān)測(cè)小鼠機(jī)體動(dòng)脈血壓的變化，檢測(cè)小鼠尿蛋白肌酐比值，血清尿素氮水平及腎小球?yàn)V過率的變化，以及檢測(cè)腎組織中COL-I，COL-IV，TGF-β，PAI-1，AT1等基因表達(dá)水平的改變，觀察腎臟病理切片中的組織損傷程度，研究PGE2受體EP3的在高血壓腎臟損傷過程中對(duì)血壓變化的影響和對(duì)腎臟損傷的作用(體內(nèi)實(shí)驗(yàn))。并進(jìn)一步通過細(xì)胞

6、體外實(shí)驗(yàn)，利用LVIP2.0Zc細(xì)胞對(duì)AT1受體DNA質(zhì)粒和前列腺素E2受體EP3的DNA質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，研究EP3受體在AngⅡ-AT1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，為進(jìn)一步的腎臟病基因治療或新藥的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：1.C57BL/6小鼠分為野生型和EP3受體基因敲除型，均于實(shí)驗(yàn)-14天行單側(cè)腎切除術(shù)(右側(cè))，0天時(shí)于皮下包埋皮醋酸去氧皮質(zhì)酮(DOCA)緩釋片，并將飲用水換為1％的生理鹽水，于第7天為小鼠皮下包埋血管緊張素

7、Ⅱ(AngⅡ)迷你泵，以1.5ng/min/g體重的速度泵入血管緊張素Ⅱ，觀察至第19天，處死小鼠。在實(shí)驗(yàn)過程中以尾套法每周定期監(jiān)測(cè)小鼠動(dòng)脈血壓，收集尿液，并檢測(cè)小鼠血尿素氮，腎小球?yàn)V過率，尿蛋白肌酐比值的變化，處死小鼠時(shí)收集腎臟標(biāo)本，進(jìn)行病理觀察以及利用Q-RT-PCR技術(shù)對(duì)腎臟標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)的纖維化因子的基因表達(dá)定量檢測(cè)。
　　 2.復(fù)蘇及培養(yǎng)穩(wěn)定傳代的LVIP2.0Zc細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染進(jìn)AT1受體DNA質(zhì)粒和EP3受體DNA質(zhì)

8、粒，以不同濃度的AT1受體激動(dòng)劑AngⅡ和EP3受體激動(dòng)劑sulprostore對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行刺激，用熒光標(biāo)記法使用Flex station對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的濃度進(jìn)行觀察，監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.(1)在實(shí)驗(yàn)過程中，小鼠包埋AngⅡ迷你泵后，野生型小鼠(WT組)23只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，16只死亡，死亡率為70％。19只EP3基因敲除小鼠(EP3-/-組)中7只死亡，死亡率為37％，使用Chi-Squar

9、e統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法顯示兩組小鼠的生存率差異為0.0376，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。且在WT組小鼠中，大量小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的腹水，甚至全身性水腫，而EP3-/-組小鼠，即使在死亡小鼠中水腫也比較少見。其差異體現(xiàn)于使用AngⅡ后對(duì)兩組小鼠體重改變的觀察，WT組小鼠，體重明顯增加，而EP3-/-組小鼠體重不僅未見明顯上升，反而出現(xiàn)輕微的降低，平衡了初始體重后，兩組小鼠體重變化統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(P<0.001)。
　　 (2)血壓變化，隨治療時(shí)間的推移

10、，兩組小鼠血壓明顯升高，WT小鼠的系統(tǒng)收縮壓從基礎(chǔ)值108.0±1.3 mmHg升高到190.9±3.9mmHg，EP3-/-小鼠的系統(tǒng)收縮壓從基礎(chǔ)105.7±1.6 mmHg升高至199.1±4.0 mmHg，雖然兩組小鼠經(jīng)過處理后血壓均有顯著的升高，但是卻沒有表現(xiàn)出基因型不同所引起的血壓差異(P=0.1939)。
　　 (3)腎功能，兩組小鼠的腎小球?yàn)V過率在實(shí)驗(yàn)初期并無明顯差異，經(jīng)過處理后，WT組小鼠的腎小球?yàn)V過率明顯下降至

11、2.1±0.2μgl/min/gbody weight(P<0.01)，而EP3-/-小鼠的腎小球?yàn)V過率下降至5.6±0.7μl/min/g body weight，與該組的基礎(chǔ)值相比并無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩組小鼠在實(shí)驗(yàn)終止時(shí)檢測(cè)的腎小球?yàn)V率過有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，WT組小鼠的腎功能顯著下降。與上述研究結(jié)果一致，在檢測(cè)血清尿素氮濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠經(jīng)過處理后血清尿素氮均顯著升高，WT組從基礎(chǔ)值17.6±2.7mg/dl升高至63.7±10.3

12、mg/dl，EP3-/-組從基礎(chǔ)值23.1±1.6 mg/dl升高至39.0±2.1 mg/dl，兩組基因型不同的小鼠，在實(shí)驗(yàn)終末血清尿素氮濃度差異明顯，P<0.0352，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)尿蛋白肌酐比值的觀察發(fā)現(xiàn)，植入AngⅡ泵后，WT組ACR明顯升高至2392±446.7 mg/g，EP3-/-組ACR升高至704.0±136.1 mg/g，組間差異顯著，P<0.001。
　　 (4)纖維化因子基因表達(dá)：在實(shí)驗(yàn)的初期我們可以看

13、到對(duì)于纖維化因子的表達(dá)兩種基因型不同的小鼠并沒有明顯的差異，均顯示出較低的表達(dá)值。在高血壓腎病小鼠模型建立后，COL-I，COL-IV，TGF-β以及PAI-1的mRNA表達(dá)均有所上升，且野生型小鼠(WT組)的基因表達(dá)明顯的高于EP3基因敲除小鼠(EP3-/-組)，兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01。
　　 (5)病理學(xué)光鏡檢查可見腎臟系膜基質(zhì)增生，腎小球硬化，腎小管擴(kuò)張，大量蛋白管型，腎小管上皮細(xì)胞變性，小管灶性壞死，纖維

14、化；間質(zhì)淋巴、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，伴有灶性纖維化。觀察發(fā)現(xiàn)WT組小鼠的蛋白尿，腎小球硬化程度，腎小管壞死，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化程度均較EP3-/-組小鼠嚴(yán)重。病理半定量積分顯示W(wǎng)T組小鼠腎小球硬化(GS)指數(shù)、小管間質(zhì)病理?yè)p傷(TIL)積分均高于EP3-/-組(P<0.05)。
　　 2.通過對(duì)轉(zhuǎn)染進(jìn)AT1受體DNA質(zhì)粒和EP3受體DNA質(zhì)粒的LVIP2.0Zc細(xì)胞，以不同濃度的AT1受體激動(dòng)劑AngⅡ和EP3受體激動(dòng)劑sutpr

15、ostore進(jìn)行刺激，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)轉(zhuǎn)染了AT1受體DNA質(zhì)粒的細(xì)胞，在AngⅡ的刺激下，鈣離子濃度明顯的呈劑量依賴性上升。在細(xì)胞共同轉(zhuǎn)染了AT1受體DNA質(zhì)粒和EP3受體DNA質(zhì)粒后，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度隨著AngⅡ劑量的增加而增加，但在同時(shí)增加EP3受體激活劑sulprostore后，隨著sulprostore濃度的增加，EP3受體活性的升高，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度會(huì)在AngⅡ通過AT1刺激鈣離子釋放的基礎(chǔ)上繼續(xù)上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　

16、 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：1.成功在C57BL/6小鼠基因背景上建立高血壓腎病模型，該模型以蛋白尿，腎小球損傷，腎小管病變和纖維化因子高表達(dá)為特征。
　　 2.單獨(dú)敲除EP3受體不會(huì)導(dǎo)致小鼠系統(tǒng)血壓的改變。
　　 3.前列腺素E2受體EP3在高血壓腎病模型中，可加重腎臟損傷。
　　 4.血管緊張素Ⅱ與AT1受體結(jié)合，可以誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放，使細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度增加。
　　 5.前列腺素E2受體EP3可正向調(diào)節(jié)血管