shMRE11對肝癌耐藥細胞BEL7402-5-FU耐藥性及生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的：本研究旨在利用RNA干擾技術(shù)研究MRE11沉默對肝癌耐藥細胞Be17402/5-FUDNA損傷修復(fù)功能、化療藥物敏感性、耐藥相關(guān)蛋白表達以及細胞生物學(xué)行為的影響，初步探索MRE11與肝癌耐藥性的關(guān)系。
　　 方法：1.shMRE11干擾質(zhì)粒的鑒定與擴增。2.BEL7402/5-FU和BEL7402細胞的培養(yǎng)及MTT法鑒定BEL7402/5-FU細胞的多藥耐藥性。3.shMRE11干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BEL7402/5-FU細胞并通

2、過與pEGFP-N1共轉(zhuǎn)染檢測轉(zhuǎn)染效率。4.Real-time PCR及Western blot分別檢測MRE11 mRNA及蛋白水平沉默效率。5.Western blot檢測細胞γ-H2AX蛋白表達。6.EdU法檢測細胞DNA合成。7.MTT法檢測細胞對DDP、MMC、ADM、5-FU化療藥物的敏感性。8.Real-time PCR及Western blot檢測耐藥相關(guān)蛋白MRP1 mRNA及蛋白水平的表達。9.MTT法檢測細胞增殖情

3、況。10.流式細胞術(shù)檢測細胞周期。11.AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡。
　　 結(jié)果：1.測序鑒定結(jié)果顯示shMRE11質(zhì)粒插入序列正確。2.MTT檢測結(jié)果顯示BEL7402/5-FU細胞對5-FU、ADM、DDP、MMC耐藥指數(shù)分別為11.09、2.05、2.74、2.41。3.經(jīng)pEGFP-N1評估轉(zhuǎn)染效率為47.5％。4.Real-time PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示MRE11 mRN

4、A及蛋白水平的沉默效率分別為78.0％、56.1％。5.Western blot檢測γ-H2AX表達結(jié)果顯示shMRE11實驗組較對照組增加(P<0.05)。6.EdU檢測結(jié)果顯示shMRE11實驗組DNA合成率較對照組降低(P<0.05)。7.MTT結(jié)果顯示shMRE11實驗組對DDP、MMC、ADM、5-FU IC50較對照組均降低(P<0.05)。8.Real-time PCR及Westernblot對MRP1檢測結(jié)果顯示shMR

5、E11實驗組與對照組相比MRP1 mRNA及蛋白水平表達均有所降低(P<0.05)。9.MTT細胞增殖檢測結(jié)果顯示shMRE11實驗組與對照組相比細胞增殖速度減慢(P<0.05)。10.流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示shMRE11實驗組S期細胞比例較對照組減少(P<0.05)。11.AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染24h、48h和72h后shMRE11實驗組的細胞凋亡指數(shù)增高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。