靶向RhoC基因慢病毒載體構(gòu)建及對黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為和DTIC耐藥性影響.pdf

1、目的：黑色素瘤是體表腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤，其高度侵襲轉(zhuǎn)移性和對于傳統(tǒng)化療藥物的耐藥性被認(rèn)為是黑色素瘤治療和預(yù)后的最大障礙。RhoC作為腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子可通過多種轉(zhuǎn)移相關(guān)機制參與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移，是控制腫瘤轉(zhuǎn)移的分子開關(guān)，RhoC有望成為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的重要靶位。RNAi技術(shù)是目前公認(rèn)快速有效的基因沉默方式，有利于進(jìn)行基因治療和表達(dá)缺失下的功能研究。
　　 目前多項研究證實RNAi技術(shù)可通過調(diào)節(jié)和關(guān)閉基因表達(dá)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的各種

2、生命活動，但應(yīng)用RNAi技術(shù)靶向RhoC基因慢病毒干擾載體的構(gòu)建、RhoC基因沉默對黑色素瘤生物學(xué)行為，尤其是侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響以及對化療藥物耐藥逆轉(zhuǎn)性的研究尚未見報道。本研究擬利用RNAi技術(shù)，以慢病毒作為基因載體，以人黑色素瘤A375細(xì)胞作為研究對象，以轉(zhuǎn)移相關(guān)基因RhoC作為靶基因，研究靶向RhoC基因慢病毒干擾載體的構(gòu)建及沉默RhoC基因?qū)w外培養(yǎng)A375細(xì)胞生物學(xué)行為包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞粘附能力、細(xì)胞侵襲能力的影響：腫

3、瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase2，MMP-2)、上皮鈣粘附素(E-cadherin)的表達(dá)水平的變化；以及對于治療黑色素瘤的化療藥物氮烯咪胺(Dacarbazine，DTIC)耐藥性的逆轉(zhuǎn)并分析其可能機制，旨在探討RhoC基因在黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為中的作用，為RhoC作為惡性腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因治療靶位的可行性、為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥及基因治療提供實驗室依據(jù)，為進(jìn)一步應(yīng)用RNAi技術(shù)治療腫瘤提供新

4、的思路。
　　 方法：
　　 1.根據(jù)RhoC編碼區(qū)基因信息設(shè)計構(gòu)建三對pGPU6/GFP/Neo-shRNA表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染人黑色素瘤A375細(xì)胞，應(yīng)用熒光定量PCR和Western blot檢測三對pGPU6/GFP/Neo-shRNA表達(dá)載體對A375細(xì)胞RhoC mRNA及蛋白表達(dá)的沉默效應(yīng)從而篩選出最有效的靶序列。
　　 2.將RNAi效應(yīng)最佳的序列進(jìn)一步構(gòu)建至pcDNA6.2-EmGFP-miR中并進(jìn)

5、行慢病毒包裝構(gòu)建形成靶向RhoC pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表達(dá)載體，測序并感染A375細(xì)胞，進(jìn)一步應(yīng)用熒光定量PCR和Western blot檢測對RhoC mRNA及蛋白表達(dá)的沉默效應(yīng)。
　　 3.體外實驗中，將pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表達(dá)載體感染人黑色素瘤A375細(xì)胞，應(yīng)用熒光定量PCR和Western blot檢測RhoC基因沉默后轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP-2，E-cadherin mRNA及

6、蛋白表達(dá)；應(yīng)用Transwell小室細(xì)胞侵襲實驗檢測A375細(xì)胞侵襲能力；應(yīng)用細(xì)胞粘附實驗檢測對層粘連蛋白和纖維粘連蛋白的粘附能力；應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞增殖；應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；應(yīng)用MTT法檢測對化療藥物氮烯咪胺(DTIC)耐藥性的逆轉(zhuǎn)率。同時應(yīng)用上述各種方法對對照組相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行檢測。
　　 統(tǒng)計學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。多樣本均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD比較或Dunnett T3

7、比較。以p<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.構(gòu)建的三對shRNA表達(dá)載體分別為pGPU6/GFP/Neo-shRNA336、pGPU6/GFP/Neo-shRNA453及pGPU6/GFP/Neo-shRNA680，應(yīng)用熒光定量PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染人黑色素瘤A375細(xì)胞后靶基因RhoC mRNA和蛋白表達(dá)水平分別為1.47±0.26、1.13±0.16、1.39+0.11和70

8、.98±9.21、50.67±6.06、65.77±4.06，pGPU6/GFP/Neo-shRNA453為最有效干擾序列。
　　 2.成功構(gòu)建了靶向RhoC的pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表達(dá)載體，經(jīng)測序證實序列正確；將構(gòu)建的pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表達(dá)載體感染人黑色素瘤A375細(xì)胞，應(yīng)用熒光定量PCR和Western blot檢測RhoC mRNA和蛋白的表達(dá)水平分別為1.05±0.05、62.

9、04±15.86，而陰性對照慢病毒組、正常對照組RhoC mRNA和蛋白分別為4.21±0.24、220.86±24.07和4.63±0.32、257.39±12.30，慢病毒表達(dá)載體組較對照組相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.體外實驗中，將pLenti6.3-EGFP-453慢病毒載體感染人黑色素瘤A375細(xì)胞，應(yīng)用熒光定量PCR和Western blot檢測RhoC基因沉默后轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP-2mRNA

10、和蛋白的表達(dá)水平分別為1.17±0.16，66.40±14.51；而陰性對照慢病毒組、正常對照組MMP-2 mRNA和蛋白分別為2.28±0.31、112.59±23.27；2.75±0.90、135.88±26.16；pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組與對照組相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。應(yīng)用熒光定量PCR和Western blot檢測pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組E-cadherin mRNA和蛋

11、白的表達(dá)水平分別為2.95±0.71、125.17±19.88；而陰性對照慢病毒組、正常對照組E-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)水平分別為1.80±0.47、77.39±13.38；0.97±0.54、47.91±18.69；pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組與對照組相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4.體外實驗中，Transwell小室細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果顯示：pLenti6.3-EGFP-453

12、慢病毒組穿膜細(xì)胞數(shù)為40.41±8.88，較陰性對照慢病毒組、正常對照組明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；陰性對照慢病毒組穿膜細(xì)胞數(shù)為64.82±13.48，正常對照組為77.46±6.47，陰性對照慢病毒組較正常對照組輕微下降，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)晶紫染色法細(xì)胞粘附實驗結(jié)果顯示：pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組A375細(xì)胞對層粘連蛋白(Ln)和纖維粘連蛋白(Fn)的粘附能力較慢病毒陰性對照

13、組、正常細(xì)胞對照組明顯下降，通過酶標(biāo)儀測定光密度OD值，pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組對Ln和Fn的OD值分別為0.467±0.005、0.321±0.007，較陰性對照慢病毒組、正常對照組明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；陰性對照慢病毒組對Ln和Fn的OD值分別為0.532+0.005、0.376±0.004，正常細(xì)胞組分別為0.544±0.008、0.381±0.007，陰性對照慢病毒組較正常對照組輕微下降

14、，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 5.體外實驗中，MTT法檢測細(xì)胞增殖結(jié)果顯示：24h時間點pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組吸光度為0.319±0.004，與陰性對照慢病毒組、正常對照組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。72h、120h及168h時間點時，pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組吸光度分別為0.337±0.004、0.369±0.004和0.397±0.005；而陰性對照慢病

15、毒組、正常對照組吸光度分別為0.350±0.001、0.389±0.002、0.425±0.006和0.355±0.003、0.404±0.005、0.4404±0.010；pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組的細(xì)胞增殖較兩對照組下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 MTT法檢測pLenti6.3-EGFP-453慢病毒感染人黑色素瘤A375細(xì)胞后對DTIC耐藥性影響結(jié)果顯示：DTIC終濃度為0.01μg/m

16、l、0.1μg/ml、1.0μg/ml、10μg/ml時，慢病毒表達(dá)載體聯(lián)合藥物組抑制率分別為8.82％、14.01％、23.15％和33.51％；單獨藥物組抑制率分別為1.97％、7.79％、13.57％和20.37％，在單獨使用不同藥物濃度DTIC作用下，IC50值為254.99μg/ml，而聯(lián)合應(yīng)用pLenti6.3-EGFP-453慢病毒和藥物DTIC作用下，IC50值下降為162.41μg/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.57倍。流式細(xì)胞

17、術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組細(xì)胞凋亡率為13.36±0.39％，與陰性對照慢病毒組、正常對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，陰性對照慢病毒組細(xì)胞凋亡率為4.78±0.45％，正常對照組為3.98±0.41％，兩對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建的靶向RhoC基因的pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表達(dá)載體可高效感染體外培

18、養(yǎng)的人黑色素瘤A375細(xì)胞，并可顯著抑制靶基因RhoC mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 2.pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表達(dá)載體RhoC基因沉默后，可明顯下調(diào)體外培養(yǎng)的人黑色素瘤A375細(xì)胞的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP-2表達(dá)，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)。腫瘤細(xì)胞侵襲和粘附能力明顯抑制。RhoC基因沉默可能通過對腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控來實現(xiàn)對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。
　　 3.pLenti6.3-EG