Lgr5對胃癌的惡性生物學行為和化療耐藥性的影響及機制研究.pdf

1、背景：
　　胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,每年大約有100萬新發(fā)病例。胃癌在癌癥相關性死亡中排在第二位。近年來,盡管胃癌的診療技術不斷提高,由于胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移,導致其5年生存率仍然低于30％。大量的研究認為腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移高度依賴于腫瘤細胞的增殖和血管生成,抗血管生成治療可以使胃癌患者生存獲益。此外,在治療進展期胃癌過程中,術前化療被廣泛應用,因為這種方法可以縮小腫瘤,降低腫瘤的分期,提高腫瘤的切除率,從而改善患者預后。然而

2、,由于化療耐藥性的存在,僅有20%的胃癌患者能夠完全或部分緩解。因此,為了提高胃癌的治療效果,需要尋找與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成和化療耐藥性相關的特異分子并深入研究其調(diào)節(jié)機制。
　　目的：
　　研究Lgr5在胃癌中的表達情況,分析其與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成、化療耐藥性及預后的關系,并進一步探討具體作用機制。此外,我們還對接受術前化療的胃癌患者進行研究,探討Lgr5在評價化療效果及判斷預后方面的價值。
　　方法：<

3、br>　　1.收集318例經(jīng)根治性手術治療的胃癌患者,進行隨訪。利用免疫組織化學染色檢測Lgr5、MMP2、EphA3、VEGF和CD34在318例胃癌和80例正常胃黏膜組織中的表達。CD34免疫染色用來計數(shù)微血管密度(MVD)。通過Westernblot方法檢測了75例胃癌新鮮組織標本及相對應的癌旁正常組織中Lgr5,MMP2,EphA3和VEGF蛋白表達情況。并對Lgr5與臨床病理學特征之間的關系進行了綜合分析。
　　2.應用

4、qRT-PCR和Westernblot技術篩選Lgr5高表達的胃癌細胞株。通過RNA干擾技術敲低胃癌細胞中Lgr5的表達。通過qRT-PCR和Westernblot技術分析沉默Lgr5對MMP2,EphA3和VEGFmRNA和蛋白表達的影響。通過MTT實驗檢測沉默Lgr5基因?qū)ξ赴┘毎鲋衬芰Φ挠绊憽２捎肁nnexinV-FITC/PI雙染流式細胞術檢測沉默Lgr5對胃癌細胞凋亡的影響。采用Transwell和細胞劃痕修復實驗觀察Lgr

5、5siRNA對胃癌細胞侵襲和遷移能力的影響。利用MTT法和二維凝膠血管生成體外模型探討Lgr5沉默后的胃癌細胞培養(yǎng)上清液對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(humanumbulicalveinendotheliacell,HUVEC)增殖和管狀結(jié)構形成的影響。
　　3.采用MTT法和AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞技術檢測Lgr5siRNA對接受奧沙利鉑和5-FU作用的胃癌細胞的存活率和凋亡率。收集68例接受新輔助化療的胃癌患者石

6、蠟標本。通過免疫組織化學染色方法檢測胃癌組織中Lgr5表達情況,并分析其表達與該類患者的臨床病理學特征之間的關系。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化染色結(jié)果顯示:Lgr5在胃癌組織中的陽性表達率明顯高于正常粘膜組織(P=0.001)。Lgr5陽性率隨著侵潤深度增加(T分期)而增高(P=0.001),并且與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.001)和遠處轉(zhuǎn)移(P=0.001)相關。多因素生存分析顯示Lgr5是影響胃癌患者預后的獨立因子(P=

7、0.001)。通過Spearman等級相關檢驗顯示Lgr5表達與MMP2、EphA3、VEGF和MVD呈正相關(P=0.001)。對Westernblot檢測結(jié)果行Pearson相關檢驗也進一步驗證這一相關性((Lgr5vsMMP2:P=0.001,r=0.875;Lgr5vsEphA3:P=0.001,r=0.474;Lgr5vsVEGF:P=0.001,r=0.921).
　　2.Lgr5在胃癌細胞系AGS中表達量最高。沉默A

8、GS細胞中Lgr5基因可以導致MMP2、EphA3和VEGF表達明顯下降(P=0.001)。同時我們還發(fā)現(xiàn)沉默Lgr5以后,AGS細胞的增殖、遷徙和遷移能力顯著降低(P=0.001),凋亡率顯著增高(P=0.001)。Lgr5沉默的胃癌AGS細胞培養(yǎng)液可以抑制HUVEC細胞增殖能力。此外,當利用Lgr5沉默的AGS細胞上清液培養(yǎng)HUVEC時,管狀結(jié)構形成(2.51±0.19mm/mm2)相比空白對照組(7.34±0.30mm/mm2)和

9、陰性對照組(7.18±0.33mm/mm2)明顯減少,差異具有顯著性(P=0.001,P=0.001)。
　　3.在化療藥物奧沙利鉑和5-FU作用下,Lgr5基因沉默的AGS細胞的存活率較空白對照組和陰性對照組明顯下降(P=0.001),凋亡率較空白對照組和陰性對照組顯著增加(P=0.001)。腫瘤消退情況差的胃癌中Lgr5陽性表達率顯著高于腫瘤消退情況好的胃癌(P=0.001)。將化療前后兩組Lgr5表達情況進行配對分析,發(fā)現(xiàn)化

10、療前Lgr5表達較化療后低(P=0.001)。多因素分析結(jié)果顯示Lgr5與接受術前化療的胃癌患者預后相關,可以作為判斷預后的獨立因子(P=0.039)。
　　結(jié)論：
　　1.Lgr5與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關,可以作為判斷胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成情況以及患者預后的參考指標。
　　2.沉默Lgr5基因可以有效地抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為。Lgr5沉默后胃癌AGS細胞培養(yǎng)液可以抑制HUVEC細胞增殖和管狀結(jié)構

11、形成能力。Lgr5siRNA可以有效抑制β-catenin蛋白、MMP2、EphA3、VEGFmRNA和蛋白的表達。這表明胃癌中Lgr5的表達可以通過激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路,從而促進MMP2、EphA3和VEGFmRNA的轉(zhuǎn)錄
　　3.Lgr5可以作為預測化療療效的有效指標,同時也可以作為獨立影響因子來判斷接受術前化療胃癌患者的預后。沉默Lgr5基因以后可以顯著降低AGS細胞的化療耐藥性。
　　4.Lgr