MDV部分流行株致病基因分析及疫苗免疫保護(hù)評(píng)價(jià).pdf

1、馬立克氏病(MD)是雞的一種高度傳染性、淋巴組織增生性疾病。該病廣泛流行，是一種嚴(yán)重危害家禽的傳染病。該病的致病因子為馬立克氏病病毒(MDV)，屬α-皰疹病毒，包括1、2、3三種血清型(MDV1；MDV2；HVT)，3種血清型病毒間存在血清學(xué)交叉反應(yīng)。MDV基因組龐大，由多類功能基因組成。其中致病基因包括：1)與致病性直接相關(guān)的基因；2)與致病性間接相關(guān)的基因；3)致病輔助性基因。它們?cè)诓煌玖DV毒株之間存在差異，這些差異與致病性具

2、有一定相關(guān)性，對(duì)MDV的致病機(jī)制研究具有重要的作用。其中Meq基因作為致病直接相關(guān)基因，和MDV腫瘤的形成是直接相關(guān)的；132bp重復(fù)序列是MDV-1所獨(dú)有的，其在病毒基因組中拷貝數(shù)的多少可能與致病性相關(guān)；RLORF-4基因是致病間接相關(guān)基因，間接參與致病的調(diào)控。MDV的致病機(jī)理比較復(fù)雜，病毒在體內(nèi)的復(fù)制情況也不是很清楚。通過(guò)對(duì)我國(guó)五省分離的MDV毒株的致病相關(guān)基因分析及分離病毒在體內(nèi)復(fù)制的研究，對(duì)MDV在我國(guó)的發(fā)生、流行及防控具有重要

3、意義。 本研究根據(jù)已發(fā)表的MDVGA株基因組序列，分別設(shè)計(jì)Meq基因、RLORF-4基因及132bp重復(fù)序列的特異性引物，通過(guò)PCR方法分別擴(kuò)增近兩年從我國(guó)5個(gè)省分離毒株相應(yīng)基因片段。將擴(kuò)增的Meq基因及RLORF-4基因特異片段分別克隆入T載體。進(jìn)行序列測(cè)定和比較分析。通過(guò)瓊脂糖電泳分析不同毒株基因組中132bp重復(fù)序列的拷貝數(shù)。并對(duì)其中三株分離毒株分別進(jìn)行致病性試驗(yàn)。通過(guò)HVT單價(jià)疫苗和HVT+SB-I雙價(jià)疫苗對(duì)分離毒株的免

4、疫保護(hù)作用，分析毒株的致病性。應(yīng)用瓊脂糖凝膠沉淀試驗(yàn)(AGP)及常規(guī)PCR方法對(duì)試驗(yàn)雞進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)運(yùn)用熒光定量PCR方法，對(duì)這些羽髓中的病毒載量進(jìn)行定量檢測(cè)，確定病毒在體內(nèi)的復(fù)制情況，研究病毒在體內(nèi)的增值規(guī)律。 對(duì)國(guó)內(nèi)分離毒株Meq基因、RLORF-4基因序列、132bp重復(fù)序列的拷貝數(shù)的比較，以及分離毒株的致病性、體內(nèi)增值規(guī)律的研究表明：Meq基因作為MDV致病直接相關(guān)基因，不同毒株的氨基酸序列存在突變，這些突變和病毒的毒力

5、存在一定的相關(guān)性，其中兩點(diǎn)突變是國(guó)內(nèi)流行毒株所獨(dú)有的；RLORF4基因作為可能和致病相關(guān)的基因，一級(jí)結(jié)構(gòu)序列未發(fā)現(xiàn)有意義的突變，強(qiáng)弱毒株之間變異不大；分離毒株的132bp重復(fù)序列拷貝數(shù)都是2個(gè)，符合MDV1強(qiáng)毒株的特點(diǎn)。我們也發(fā)現(xiàn)疫苗株814的132bp重復(fù)序列拷貝數(shù)為2個(gè)，這說(shuō)明用132bp重復(fù)序列拷貝數(shù)的多少來(lái)區(qū)分強(qiáng)弱毒株存在例外情況。在3株分離毒株的致病性試驗(yàn)中，感染雞的MD發(fā)病率在71～94％之間，而HVT單價(jià)疫苗及雙價(jià)疫苗免疫

6、的雞只中仍可引起18～41％和18～33％的發(fā)病率，表明這3株MDV的毒力介于強(qiáng)毒(vMDV)和超強(qiáng)毒(vvMDV)之間。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)3株分離株在雞羽髓中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)MDV強(qiáng)毒株相比，分離毒株在雞體內(nèi)有較高的復(fù)制能力，并且病毒滴度的峰值來(lái)臨的更早，二次溶細(xì)胞感染發(fā)生的更加顯著，是MDV流行毒株一個(gè)新的特點(diǎn)。 通過(guò)對(duì)MD國(guó)內(nèi)流行毒株致病相關(guān)基因及病毒在體內(nèi)增值的研究，確定了毒株致病直接相關(guān)基因的變化同