JEV多表位基因重組痘苗病毒安卡拉株(rMVA-mep)及其免疫效果評價.pdf

1、日本腦炎病毒Japaneseencephalitisvirus(JEV)（簡稱乙腦）屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種由蚊蟲傳播引起人類或馬的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病毒性疾病。豬是JEV的中間宿主，因此，控制豬的乙腦不僅對養(yǎng)豬業(yè)而且對人類健康都具有十分重要的意義。在許多亞洲國家使用的第一代疫苗是乙腦病毒的滅活苗和弱毒苗，都取得了很大的成就，但是鼠腦來源的乙腦疫苗在過敏問題上越來越突出，使用滅活疫苗的一個主要問題是缺乏長效免疫，由于需要多次重復(fù)免疫

2、，使得免疫程序繁瑣。因此國際上對改善發(fā)展新的乙腦疫苗的要求很迫切。WHO正在呼吁改善和研制新型乙腦疫苗，乙腦病毒的E蛋白與病毒和細(xì)胞受體結(jié)合、膜融合有關(guān)，也是引起中和抗體及宿主保護(hù)的主要免疫蛋白。因此，利用乙腦E蛋白研究安全、高效、廉價的新型疫苗來防制JEV具有十分重要的意義。
　　 改良型痘苗病毒安卡拉株(Modifiedvacciniavirusankara，MVA，1987年11月15日保藏于CNCM，保藏號1-721)被

3、認(rèn)為是最具潛力的病毒載體之一，MVA的生活周期允許疫苗抗原在感染細(xì)胞的細(xì)胞漿中合成，對抗原分子向MHC-Ⅰ類分子有效遞呈，引發(fā)特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)特別有利。與復(fù)制型痘苗病毒不同，MVA的宿主范圍很窄，對人類及其他哺乳動物僅產(chǎn)生一過性感染，接種后的副反應(yīng)小。因此，許多利用MVA作載體的試驗(yàn)性疫苗已經(jīng)在動物模型中顯示了良好的保護(hù)性體液免疫與細(xì)胞免疫反應(yīng)。由于MVA突出的安全性能和免疫原性，近年來通過基因重組構(gòu)建的rMVA已被廣泛應(yīng)用于種

4、重要病原和腫瘤的疫苗研制當(dāng)中，并已取得良好效果。也正是由于MVA載體具有的這些優(yōu)點(diǎn)，使其從眾多的活病毒載體中脫穎而出，成為當(dāng)前重組痘苗病毒活載體疫苗研究的熱點(diǎn)。
　　 表位(epitope)是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱抗原決定簇(antigenicdeterminant)。它是T細(xì)胞抗原受體(Tcellreceptor,TCR)和B細(xì)胞抗原受體(Bcellreceptor,BCR)與抗體特異結(jié)合的基本單位。在免

5、疫應(yīng)答中，TCR和BCR所識別的抗原表位不同，分別被稱為T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。作為理想的免疫原，抗原分子中應(yīng)同時包含目的抗原B細(xì)胞表位和自身或外源T細(xì)胞表位，才能誘導(dǎo)出高度特異性的體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)，在體液免疫和細(xì)胞免疫水平起到預(yù)防或治療作用，賦予較廣泛的保護(hù)性。目前關(guān)于表位疫苗的設(shè)計策略取得了較大的研究進(jìn)展，因此表位疫苗成為近年來病毒新型疫苗研究的熱點(diǎn)。
　　 本研究以JEV多表位肽multiple-epitopepepti

6、de（日本腦炎病毒E蛋白上6個主要的B細(xì)胞表位，一個CTL表位和一個Th表位基因串聯(lián)，命名為mep，長度為437bp）為目標(biāo)基因，以MVA為載體構(gòu)建表達(dá)JEV多表位基因mep的重組MVA，并用重組MVA免疫小鼠研究其免疫原性及保護(hù)效力，希望為研制具有高免疫原性的乙腦病毒多表位疫苗提供依據(jù)。具體的研究內(nèi)容如下:
　　 1、表達(dá)日本腦炎病毒E蛋白多表位基因重組MVA的構(gòu)建及純化
　　 以NheⅠ/XhoⅠ酶切位點(diǎn)，從重組表達(dá)

7、質(zhì)粒pET28-MEP上擴(kuò)增出mep基因克隆到pMD18-T載體，命名為pMD18-mep，測序正確保存。用NheⅠ/XhoⅠ雙酶切pMD18-mep和轉(zhuǎn)移載體pGEM-K1L，回收目的片段和載體，以合適的比例進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5a，提取質(zhì)粒NheⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，取陽性重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒保存，命名為pGEM-K1L-mep。
　　 野生型MVA感染的BHK-21細(xì)胞，培養(yǎng)2-3h。然后通過脂質(zhì)體Lipofectamine

8、TM2000將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pGEM-K1L-mep轉(zhuǎn)染被野生型MVA感染的BHK-21細(xì)胞，培養(yǎng)4-6h，換新的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24-36h，重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pGEM-K1L-mep與野生型MVA基因組發(fā)生同源重組，細(xì)胞病變后反復(fù)凍融3次收毒保存，命名為recombinantvirus1，簡稱rv1，其中包含獲得的重組痘苗病毒(命名為rMVA-mep)和未重組的野生型MVA。
　　 將rv1按照合適的比例感染RK-13細(xì)胞，反復(fù)

9、傳代以去除混合物里的野生型MVA，每代病毒液都進(jìn)行重組痘苗病毒存在性檢測。傳5-6代經(jīng)檢測野生型MVA已完全去除的病毒液（命名為rv2），按照合適的比例感染長成單層的BHK-21細(xì)胞，反復(fù)傳代（約5-6代）以去除宿主限制性篩選基因K1L，每代病毒液都進(jìn)行K1L基因存在性檢測，重組痘苗病毒命名為rMVA-mep，病毒滴度為108TCID50/mL。
　　 2、在小鼠模型上的免疫原性和保護(hù)效力研究
　　 4～6周齡雌性BAL

10、B/c小鼠隨機(jī)分成8組，每組15只。將野生型MVA（對照）、PBS（對照）和三種不同劑量(105TCID50，106TCID50，107TCID50)rMVA-mep分別以腹腔接種的方式給小鼠進(jìn)行3次免疫，每次免疫間隔2周;將rMEP蛋白（實(shí)驗(yàn)室保存，濃度為10mg/mL）、EDⅢ蛋白（實(shí)驗(yàn)室保存，濃度為5mg/mL）和滅活苗分別以皮下接種的方式給小鼠進(jìn)行3次免疫，每次免疫間隔2周。然后通過測定抗體水平、抗體亞型、中和抗體、細(xì)胞因子（I

11、L-4和IFN-γ）和淋巴細(xì)胞增殖水平，并做了攻毒保護(hù)試驗(yàn)來衡量重組痘苗病毒rMVA-mep的免疫效果。結(jié)果表明，rMVA-mep既能誘導(dǎo)體液免疫又能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。抗體亞型分析結(jié)果表明，rMVA-mep既能誘導(dǎo)IgG1的分泌又能誘導(dǎo)IgG2a的分泌，但以IgG1為主;細(xì)胞因子檢測結(jié)果進(jìn)一步表明rMVA-mep主要誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生，因此說明rMVA-mep既能誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答，也能誘導(dǎo)產(chǎn)生Th2型免疫應(yīng)答。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:P

12、BS對照組存活率為8.33％（12只小鼠，存活1只）。與PBS對照組比較，野毒MVA免疫組的存活率為0。最高免疫劑量為107TCID50的rMVA-mep免疫組存活率為100％，與rMEP蛋白免疫組、EDⅢ蛋白免疫組和滅活苗免疫組存活率(100％)一致。因此rMVA-mep可以作為一種候選的基因工程重組病毒亞單位疫苗。
　　 綜上所述，構(gòu)建的乙腦病毒E蛋白多表位基因重組痘苗病毒能夠刺激小鼠產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，