腺病毒介導(dǎo)HVEM基因突變體轉(zhuǎn)染延長(zhǎng)小鼠異位心臟移植物存活的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景： 器官移植后器官功能維持的主要障礙是術(shù)后排斥反應(yīng)和免疫抑制劑毒性。共刺激信號(hào)是調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫反應(yīng)狀態(tài)的重要機(jī)制，直接影響移植后機(jī)體T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)的發(fā)生及反應(yīng)強(qiáng)弱。NaiveT細(xì)胞的激活除了需要MHC-抗原肽提供的第一信號(hào)以外，還需要共刺激分子提供的第二信號(hào)。CD28分子家族提供的第二信號(hào)能夠提供給T細(xì)胞激活所需的第二信號(hào)，共抑制分子在自身耐受和防止自身免疫疾病的維持和發(fā)生中也扮演了重要的角色，近期克隆出的HVEM-B

2、TLA分子途徑是繼CTLA4和PD1之后的又一個(gè)對(duì)T細(xì)胞激活有重要調(diào)控作用的分子。近年的發(fā)現(xiàn)顯示CD28家族的BTLA分子與TNFR超家族的HVEM分子是一對(duì)發(fā)揮對(duì)T細(xì)胞活化調(diào)控的分子基礎(chǔ)之一。HVEM除了能夠與BTLA結(jié)合之外，它還是淋巴毒素(LT)和LIGHT分子的配體，其中HVEM-LIGHT途徑在T細(xì)胞激活過(guò)程中扮演的是一個(gè)激活效應(yīng)。 在我們的研究中我們對(duì)HVEM分子進(jìn)行改造，其中對(duì)LIGHT結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了突變處理，刪除

3、其與LIGHT分子途徑的效應(yīng)，保留對(duì)BTLA分子途徑的效應(yīng)。并將其構(gòu)建到復(fù)制缺陷型腺病毒轉(zhuǎn)染載體中，對(duì)移植物進(jìn)行原位的基因轉(zhuǎn)染，觀察其對(duì)小鼠異位心臟移植物存活的影響。 目的： 通過(guò)巢式PCR擴(kuò)增HVEM全長(zhǎng)cDNA片斷，并對(duì)其進(jìn)行分子改造；將突變后的HVEM分子構(gòu)建到帶EGFP基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體中，構(gòu)建雙表達(dá)腺病毒載體；觀察HVEM突變體對(duì)體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)的影響和對(duì)小鼠實(shí)體器官轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定；建立小

4、鼠小鼠異位心臟移植模型同時(shí)觀察HVEM突變體轉(zhuǎn)染對(duì)心臟移植物存活的影響。 方法： 用巢式PCR擴(kuò)增HVEM全長(zhǎng)cDNA，并用PCR的方法對(duì)cDNA片段中LIGHT結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，將HVEM突變體基因片斷插入復(fù)制缺陷型腺病毒載體，構(gòu)建帶HVEM基因和EGFP基因雙表達(dá)的腺病毒基因組重組質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞，篩選HVEM和EGFP高效表達(dá)的重組腺病毒，對(duì)腺病毒毒性和可復(fù)制性進(jìn)行檢測(cè)；通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MIR

5、)檢測(cè)HVEM蛋白的生物學(xué)功能；通過(guò)對(duì)比常溫和低溫對(duì)腺病毒轉(zhuǎn)染實(shí)體臟器效率的影響，并觀測(cè)目的基因在心臟等實(shí)體臟器中的表達(dá)；改良并穩(wěn)定建立同種異體小鼠頸部異位心臟移植模型，應(yīng)用小鼠異位心臟移植模型平臺(tái)觀察攜帶HVEM突變體基因腺病毒對(duì)小鼠心臟移植物存活的影響。 結(jié)果： (i)成功構(gòu)建了含有HVEM突變體的重組腺病毒載體； (ii)該重組腺病毒能成功地使靶細(xì)胞表達(dá)HVEM突變體蛋白，并且具有相應(yīng)的生物學(xué)功能。