

版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、前言:
前列腺癌是男性中最常見(jiàn)的上皮惡性腫瘤之一,患者早期無(wú)明顯特異性臨床癥狀,因此,確診時(shí)多數(shù)患者已發(fā)展至中晚期,患者錯(cuò)過(guò)癌癥最佳治療時(shí)期,導(dǎo)致前列腺癌患者預(yù)后效果差、死亡率高。遺傳因素、過(guò)多性生活、不良飲食習(xí)慣等因素增加了前列腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn),使得前列腺癌具有較高的發(fā)病率。因此,前列腺癌的治療成為了廣大科研工作者的研究重點(diǎn)。
手術(shù)、化療和放療是癌癥治療的常見(jiàn)治療方式。手術(shù)治療作為癌癥治療的首選能夠完全移除腫瘤,然而
2、對(duì)晚期腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療效果有限,同時(shí)對(duì)患者造成永久性創(chuàng)傷?;熥鳛槿碇委熓侄文軌驓喾N腫瘤細(xì)胞且取得了良好的癌癥治療效果。然而由于化療藥物缺乏特異性,常引起患者出現(xiàn)免疫功能低下、肝腎損傷、骨髓抑制等不良反應(yīng),限制了化療藥物癌癥治療的應(yīng)用。放療在腫瘤治療中的地位和作用受到了廣泛的關(guān)注,然而放療受腫瘤病理分級(jí)、細(xì)胞分化程度、增殖速度、細(xì)胞含氧量等多種因素影響,降低了放療應(yīng)用范圍。內(nèi)分泌治療是中晚期前列腺癌治療的首選治療方案,但內(nèi)分
3、泌治療難以完全殺滅腫瘤細(xì)胞,并且導(dǎo)致雄激素非依賴性前列腺癌的發(fā)生以及性欲減退、肌力降低等多種副作用。因此,尋找新型方案成為了前列腺癌治療的關(guān)鍵。
腫瘤免疫治療是一種利用免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞的新型癌癥治療方式,具有副作用小、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。其通過(guò)提高腫瘤細(xì)胞免疫原性以及免疫效應(yīng)細(xì)胞的腫瘤殺傷敏感性達(dá)到有效殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。樹(shù)突細(xì)胞(Dendritic cell,DC)作為專職抗原呈遞細(xì)胞,能夠有效攝取和加工處理抗原,然后通過(guò)主
4、要組織相容性復(fù)合物(Major histocompatibility complex,MHC)-Ⅰ呈遞抗原并激活初始T細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)啟動(dòng)、調(diào)控和維持免疫應(yīng)答的作用。細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CytotoxicTlymphocyte,CTL)能夠根據(jù)呈遞的抗原而特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞,能夠通過(guò)Fas/FasL途徑促進(jìn)促凋亡相關(guān)蛋白分泌,同時(shí)釋放穿孔素與顆粒酶達(dá)到溶解細(xì)胞的目的。因此,選擇合適抗原決定CTL的腫瘤識(shí)別能力和抗腫瘤功能。
前列腺干細(xì)
5、胞抗原(Prostate stem cell anti gen,PSCA)主要在前列腺上皮細(xì)胞表面表達(dá),其通過(guò)葡萄糖磷脂酰肌醇共價(jià)錨定于細(xì)胞膜表面。PSCA在惡性腫瘤組織如前列腺癌、胰腺癌等腫瘤中高表達(dá),其表達(dá)程度與腫瘤組織病理分級(jí)、分化程度、播散程度等呈正相關(guān),并且在正常人類組織組織如前列腺基底細(xì)胞表面中呈現(xiàn)低表達(dá)。由于PSCA是一種特異性膜表達(dá)抗原,而不是分泌型,與PSA、PAP等分泌型抗原相比具有獨(dú)一無(wú)二的優(yōu)勢(shì)在誘導(dǎo)免疫耐受方面,
6、所以PSCA不僅是前列腺癌等相關(guān)腫瘤診斷及預(yù)后判斷的重要生物學(xué)指標(biāo),同時(shí)也是腫瘤免疫治療的潛在的重要靶點(diǎn)。由于其特有的性質(zhì)和明顯的優(yōu)勢(shì)使PSCA成為了腫瘤免疫治療的理想靶點(diǎn)。
來(lái)自自身細(xì)胞突變的前列腺癌細(xì)胞具有較弱的抗原性,同時(shí)其能夠分泌多種細(xì)胞因子而抑制DC的抗原攝取和呈遞能力,導(dǎo)致腫瘤患者免疫功能低下。因此,提高DC的抗原攝取和呈遞能力對(duì)提高機(jī)體腫瘤細(xì)胞殺傷能力具有重要意義。重組腺病毒是重要的分子生物學(xué)工具,能將外源基因轉(zhuǎn)
7、至細(xì)胞內(nèi)且能夠促進(jìn)蛋白分子持續(xù)表達(dá)而不損傷細(xì)胞,同時(shí)具有安全性好、轉(zhuǎn)染效率高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。因此利用重組腺病毒能夠引起DC持續(xù)性表達(dá)PSCA,提高了DC抗原加工處理和呈遞能力。
本研究擬構(gòu)建PSCA重組腺病毒表達(dá)載體,通過(guò)轉(zhuǎn)染人DC而提高其抗原呈遞能力以及激活初始T淋巴細(xì)胞能力,從而獲得抗原特異性CD8+ CTL。同時(shí)檢測(cè)了PSCA特異性CD8+CTL的前列腺癌細(xì)胞細(xì)胞殺傷效果,并進(jìn)一步進(jìn)行了動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)。
材料與
8、方法:
一、實(shí)驗(yàn)材料
1、細(xì)胞株:
PC-3(人前列腺癌細(xì)胞)、LNcap(人前列腺癌細(xì)胞)和RWPE-1(人前列腺上皮細(xì)胞)購(gòu)于ATCC。細(xì)胞培養(yǎng)及消化傳代按照ATCC細(xì)胞培養(yǎng)說(shuō)明進(jìn)行。
2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
4-5周齡Balb/c-nu/nu雄性裸鼠購(gòu)買于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,裸鼠飼養(yǎng)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照動(dòng)物福利法要求進(jìn)行。
3、組織標(biāo)本
外周血采集自成年健康男性志愿者
9、。
二、主要研究方法
1、PSCA重組腺病毒構(gòu)建以及鑒定:擴(kuò)增PSCA基因并通過(guò)Adxsi系統(tǒng)構(gòu)建復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體pAdxsi-PSCA,然后大量制備該載體。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后進(jìn)行PSCA重組腺病毒包裝以及擴(kuò)增。通過(guò)CsCl密度梯度離心進(jìn)行病毒純化,并采用TCID50法進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。通過(guò)PCR法對(duì)重組腺病毒PSCA基因進(jìn)行鑒定。
2、采集健康男性志愿者外周血,收集單核細(xì)胞源性樹(shù)突細(xì)胞,體外誘
10、導(dǎo)培養(yǎng)后進(jìn)行重組腺病毒轉(zhuǎn)染:通過(guò)密度梯度離心法收集加入淋巴細(xì)胞分離液的外周血中的單核細(xì)胞,貼壁細(xì)胞用于DC培養(yǎng),非貼壁細(xì)胞用于T細(xì)胞培養(yǎng)。利用PSCA-GFP重組腺病毒進(jìn)行DC轉(zhuǎn)染,同時(shí)通過(guò)流式細(xì)胞儀、共聚焦顯微鏡確定最佳MOI值和最佳感染時(shí)間。同時(shí)通過(guò)Western blot鑒定AdPSCA轉(zhuǎn)染DC的PSCA蛋白表達(dá)情況。
3、通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察AdPSCA轉(zhuǎn)染對(duì)DC形態(tài)影響;利用流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡檢測(cè)重組腺病毒轉(zhuǎn)
11、染DC后細(xì)胞表面分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR表達(dá)情況,同時(shí)利用ELISA法檢測(cè)重組腺病毒轉(zhuǎn)染對(duì)DC表達(dá)白介素(IL)-1O和IL-12表達(dá)影響;通過(guò)遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組腺病毒轉(zhuǎn)染對(duì)DC遷移能力的影響。
4、AdPSCA-DC與初始T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),利用CCK-8法確定AdPSCA-DC對(duì)自體及異體T淋巴細(xì)胞增殖能力的影響;經(jīng)過(guò)3輪刺激后,并利用免疫磁珠分選CD8+CTL,確定AdPSCA-DC誘導(dǎo)CD8+CTL產(chǎn)
12、生情況。
5、通過(guò)Western blot確定PC-3、LNcap和RWPE-1中PSCA表達(dá)情況;利用流式細(xì)胞儀測(cè)定AdPSCA-DC-CD8+CTL對(duì)PC-3細(xì)胞最佳殺傷比例;利用流式細(xì)胞儀測(cè)定DC-CD8+CTL、Adnull-DC-CD8+CTL和AdPSCA-DC-CD8+CTL分別對(duì)PC-3、LNcap和RWPE-1殺傷效果。
6、通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)測(cè)定在PC-3、LNcap和RWPE-1存在條件下,D
13、C-CD8+CTL、Adnull-DC-CD8+CTL和AdPSCA-DC-CD8+CTL表達(dá)干擾素(IFN)-γ表達(dá)情況。
7、檢測(cè)DC-CD8+CTL、Adnull-DC-CD8+CTL和AdPSCA-DC-CD8+CTL抑制腫瘤形成情況。
8、Balb/c-nu/nu雄性裸鼠背部皮下注射PC-3細(xì)胞,構(gòu)建前列腺癌荷瘤裸鼠模型。
9、檢測(cè)DC-CD8+CTL、Adnull-DC-CD8+CTL和AdPS
14、CA-DC-CD8+CTL對(duì)荷瘤裸鼠的腫瘤殺傷情況、體重影響以及存活時(shí)間影響。
10、利用蘇木精-伊紅(HE)染色檢測(cè)各組CD8+CTL處理后腫瘤組織病理學(xué)改變情況以及利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組CD8+CTL處理后腫瘤組織中VEGF、Bax和Bcl-2表達(dá)情況。
11、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。采用SPSS17.0對(duì)文中數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析,結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)形式表示,數(shù)據(jù)間比較采用SNK-q
15、檢驗(yàn), P<0.05代表比較有顯著差異。
結(jié)果:
1、通過(guò)酶切、瓊脂糖電泳、測(cè)序和PCR鑒定,證實(shí)成功構(gòu)建PSCA重組腺病毒載體,病毒滴度達(dá)到2.5×1011pfu/ ml;通過(guò)流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡確定最佳轉(zhuǎn)染MOI為200,最佳感染時(shí)間為48h。
2、通過(guò)Western blot證實(shí)AdPSCA轉(zhuǎn)染DC后,DC表達(dá)PSCA蛋白。
3、PSCA重組腺病毒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)DC出現(xiàn)典型形態(tài)學(xué)變化;同時(shí)DC
16、細(xì)胞表面分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR陽(yáng)性細(xì)胞率升高;AdPSCA提高了IL-12表達(dá)量同時(shí)抑制了IL-10表達(dá);同時(shí)AdPSCA提高了DC遷移能力。
4、AdPSCA-DC提高了T細(xì)胞增殖能力,同時(shí)能夠大量誘導(dǎo)CD8+CTL產(chǎn)生。
5、Western blot發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞PC-3高表達(dá)PSCA蛋白,前列腺癌細(xì)胞LNcap較高表達(dá)PSCA蛋白,前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1低表達(dá)PSCA蛋白。
17、 6、AnnexinⅤ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AdPSCA-DC-CD8+CTL最佳PC-3腫瘤細(xì)胞殺傷比例為40∶1。AdPSCA-DC-CD8+CTL對(duì)RWPE-1、LNcap和PC-3的殺傷比例達(dá)到8.87%±3.12、30.19%±4.13和52.60%±5.78,依次是Adnull-DC-CD8+CTL的1.31倍、4.54倍和7.37倍,同時(shí)是DC-CD8+CTL的1.81倍、5.81倍和10.31倍。
18、 7、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)表明:PC-3細(xì)胞刺激AdPSCA-DC-CD8+CTL高表達(dá)IFN-γ,LNcap細(xì)胞刺激AdPSCA-DC-CD8+CTL較高表達(dá)IFN-γ,RWPE-1細(xì)胞刺激AdPSCA-DC-CD8+CTL弱表達(dá)IFN-γ;相關(guān)細(xì)胞刺激后,Adnull-DC-CD8+CTL和DC-CD8+CTL弱表達(dá)IFN-γ。
8、AdPSCA-DC-CD8+CTL抑制PC-3細(xì)胞在Balb/c-nu/nu雄性裸鼠背部形成
19、腫瘤。
9、經(jīng)AdPSCA-DC-CD8+CTL處理后,荷瘤裸鼠腫瘤體積比(4.89±2.26)明顯低于PBS(27.43±2.76)、DC-CD8+CTL(25.74±2.10)和Adnull-DC-CD8+CTL(24.81±2.41)處理組,同時(shí)平均存活時(shí)間(37d)顯著長(zhǎng)于PBS(22d)、DC-CD8+CTL(22d)和Adnull-DC-CD8+CTL(22d)處理組;經(jīng)過(guò)治療后4組荷瘤裸鼠體重未見(jiàn)明顯降低。
20、> 10、AdPSCA-DC-CD8+CTL處理后,HE染色發(fā)現(xiàn)腫瘤組織出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變,免疫組織化學(xué)染色表明腫瘤組織中VEGF和Bcl-2表達(dá)量明顯下調(diào)而B(niǎo)ax表達(dá)量明顯升高。
結(jié)論:
1、本研究成功構(gòu)建PSCA重組腺病毒載體。
2、PSCA重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染促進(jìn)了DC表型及免疫功能成熟,獲得PSCA陽(yáng)性DC。
3、AdPSCA-DC促進(jìn)了T淋巴細(xì)胞增殖和CD8+CTL產(chǎn)生。
4、
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 重組腺病毒介導(dǎo)的PSMA-4-1BBL轉(zhuǎn)染樹(shù)突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)抗前列腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 重組腺病毒感染鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因治療前列腺癌.pdf
- 重組腺病毒載體介導(dǎo)CD基因-5-FC系統(tǒng)治療前列腺癌的系列實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A體內(nèi)外功能評(píng)價(jià)及治療前列腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- rpb-dr(6)調(diào)控的溶瘤腺病毒對(duì)前列腺癌細(xì)胞的殺傷作用
- NS398對(duì)小鼠前列腺癌體內(nèi)抑瘤作用的研究.pdf
- 麥冬皂苷D’經(jīng)RIP1-MLKL通路抑制前列腺癌生長(zhǎng)的體內(nèi)體外研究.pdf
- rPB-DR(6)調(diào)控的溶瘤腺病毒對(duì)前列腺癌細(xì)胞的殺傷作用研究.pdf
- 抗PSCA單克隆抗體治療前列腺癌實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 前列腺干細(xì)胞抗原(PSCA)對(duì)前列腺癌細(xì)胞周期的調(diào)控及其機(jī)制研究.pdf
- 基于PSCA的前列腺癌治療性DNA疫苗的研究.pdf
- 新型人工合成鈉離子通道阻斷劑抑制前列腺癌生長(zhǎng)的體內(nèi)體外研究.pdf
- 腺病毒介導(dǎo)的HSV-TK-GCV自殺基因治療前列腺癌的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- CD133在前列腺-前列腺增生-前列腺癌中的表達(dá).pdf
- 前列腺癌演示
- 前列腺癌護(hù)理
- 010前列腺癌
- 前列腺癌解讀
- 雙調(diào)控溶瘤腺病毒攜帶超抗原SEA基因治療前列腺癌基礎(chǔ)研究.pdf
- 前列腺癌課件
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論