漆斑菌屬膽紅素氧化酶的純化、分析及基因克隆.pdf

1、膽紅素氧化酶(BOD)是一種催化膽紅素生成膽綠素和其它物質(zhì)的一種酶.一些膽紅素氧化酶已從疣孢漆斑菌和微紫青霉等生物體中被分離純化出來.該研究對漆斑菌屬的疣孢漆斑菌和三種露濕漆斑菌進行培養(yǎng),培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn),加入26×<'-4>%的誘導劑(CuSO<,4>)可很大程度地提高這四種菌BOD的活性.我們從漆斑菌屬的四種菌中分離純化出了膽紅素氧化酶,純化過程中陽離子交換樹脂代替活性碳、低溫、甘油都有助于酶活的保持.與疣孢漆斑菌BOD相比較,露濕漆

2、斑菌3.1967BOD的分子量、膽紅素-聚丙烯酰胺凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶、糖染結果、等電點、純化條件等都不相同.這說明露濕漆斑菌3.1967BOD是不同于疣孢漆斑菌BOD的一種酶.在BOD的鑒定過程中膽紅素平板、膽紅素-聚丙烯酰胺凝膠電泳、糖染與銀染結合法是未被報導過的新方法,這些方法的應用對于BOD的鑒定很有幫助.該實驗對BOD的測定方法也有所改進,以露濕漆斑菌3.1967BOD各種性質(zhì)作根據(jù),在酶的最適反應條件下(37℃、

3、pH8.1)進行反應,膽紅素有最大吸收峰的波長440nm下測定OD值.以抗壞血酸和EDTA作為反應終止劑將反應終止在特定的時間,使酶活測定不用恒溫分光光度計,而只用普通的分光光度計就可測定,這也將有助于膽紅素酶法測定的推廣和應用.根據(jù)Genebank中疣孢漆斑菌膽紅素氧化酶(MV BOD)基因的編碼序列設計引物,利用PCR從疣孢漆斑菌的染色體DNA中擴增得到了1937bp的基因,將其克隆到T載體中,構建成重組質(zhì)粒,并對其測序,通過測序驗