ox-LDL通過LOX-1和AT1受體直接結(jié)合誘導(dǎo)心肌肥厚.pdf

1、心肌肥厚是心肌細(xì)胞對多種病理刺激的一種適應(yīng)性反應(yīng)。初期的心肌肥厚有一定的代償意義，但持續(xù)性心肌肥厚最終可導(dǎo)致心力衰竭和猝死。因此，研究心肌肥厚的分子機制具有極其重要的意義。越來越多的研究表明ox=LDL與心肌重構(gòu)和心臟功能有關(guān)。眾所周知，ox-LDL是致動脈粥樣硬化的關(guān)鍵步驟。ox-LDL能促進SMC增殖。然而，心肌細(xì)胞對刺激不能產(chǎn)生增殖反應(yīng)，主要表現(xiàn)為肥厚。因此，ox-LDL除了有致動脈粥樣硬化作用，還可能誘導(dǎo)心肌肥厚。最近的研究表明

2、ox-LDL影響了心臟的結(jié)構(gòu)和功能，該作用與傳統(tǒng)的危險因子：如生活方式、炎癥等無關(guān)。臨床研究也表明ox-LDL是早期心室重構(gòu)的危險因子，另外有研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物有減輕血管緊張素Ⅱ引起的心肌細(xì)胞肥厚作用。
　　許多研究表明，ox-LDL和血管緊張素Ⅱ及AT1之間有密切聯(lián)系。有研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL增加人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞AT1的表達；而血管緊張素Ⅱ作為一個重要的致心臟重塑及動脈粥樣硬化因子，它可通過激活A(yù)T1增加人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞LO

3、X-1的表達。LOX-1是作為ox-LDL特異性受體的一種Ⅱ型膜蛋白，它在ox-LDL引起動脈粥樣硬化及其他心血管疾病中起重要作用，ox-LDL能顯著增加兔主動脈LOX-1的表達，給予氯沙坦顯著減少LOX-1的表達。以上的研究表明LOX-1與AT1的相互作用可能與ox-LDL引起的心臟重塑有關(guān)。盡管正常心肌細(xì)胞表達LOX-1很少，但在心力衰竭的心臟，LOX-1的表達顯著上調(diào)。目前很少有研究關(guān)注LOX-1在心肌肥厚中的作用。本研究將觀察o

4、x-LDL是否引起心肌肥厚及LOX-1和AT1在此過程中的作用。
　　第一部分 ox-LDL誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚模型的建立
　　盡管ox-LDL是動脈粥樣硬化的危險因子，但最近的臨床研究表明ox-LDL參與心肌損傷，包括心力衰竭和心肌肥厚。我們推測ox-LDL可能誘導(dǎo)心肌肥厚。
　　我們首先研究ox-LDL與心肌肥厚的關(guān)系。利用8周齡野生型雄性小鼠(WT，C57BL/6)和ApoE基因敲除雄性小鼠(ApoE-/-)建立TA

5、C模型，給予普通飲食或高脂飲食。2周后，高脂飲食的ApoE-/-小鼠血清ox-LDL濃度顯著高于普通飲食的ApoE-/-小鼠。然而，高脂飲食不影響WT小鼠血清ox-LDL濃度。在TAC2周后，心肌肥厚的指標(biāo)如左心室壁厚度、心臟大小、心重/體重、心肌細(xì)胞橫截面積均明顯增高，心室容積卻下降，心功能無影響。TAC的ApoE-/-小鼠在普通飲食或高脂飲食2周后，隨著血清ox-LDL濃度的升高，心肌肥厚也逐漸加重。有趣的是：ApoE-/-小鼠在高

6、脂飲食2周后雖然沒有進行TAC也發(fā)生了心肌肥厚，并且TAC引起ApoE-/-小鼠高脂飲食的心肌肥厚程度大于ApoE-/-小鼠普通飲食+TAC的心肌肥厚。然而，WT小鼠不管是高脂飲食還是普通飲食在TAC后心肌肥厚程度相似。我們在實驗中應(yīng)用的ApoE-/-小鼠和WT小鼠未發(fā)現(xiàn)明顯的主動脈、冠狀動脈粥樣硬化斑塊。我們也在WT小鼠應(yīng)用微泵給予ox-LDL觀察到ox-LDL誘導(dǎo)WT小鼠心肌肥厚。
　　上述結(jié)果證實了ox-LDL誘導(dǎo)小鼠心肌肥

7、厚，ox-LDL加重TAC引起的心肌肥厚。
　　第二部分 ox-LDL誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大模型的建立
　　我們已經(jīng)證實在體情況下ox-LDL誘導(dǎo)心肌肥厚。因此，我們進一步研究在離體情況下ox-LDL是否也誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。首先，培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞后給予ox-LDL(50μg/ml)刺激，ox-LDL引起心肌細(xì)胞3H-亮氨酸摻入法測定的心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率明顯增加，說明ox-LDL刺激心肌細(xì)胞蛋白合成增加。其次，我們應(yīng)用α-M

8、HC免疫熒光染色心肌細(xì)胞后觀察心肌細(xì)胞表面積，結(jié)果顯示：ox-LDL刺激心肌細(xì)胞引起細(xì)胞表面積明顯增大。另外，p-ERK和一些肥厚基因ANP、SAA也是心肌細(xì)胞肥厚的重要反應(yīng)。我們用ox-LDL刺激心肌細(xì)胞不僅引起p-ERK蛋白增多，還導(dǎo)致ANP、SAA mRNA表達升高，以上結(jié)果說明ox-LDL誘導(dǎo)離體心肌細(xì)胞肥厚。
　　第三部分 ox-LDL誘導(dǎo)心肌肥厚與AT1和LOX-1受體有關(guān)
　　我們已經(jīng)證實無論是在體還是離體時o

9、x-LDL均可誘導(dǎo)心肌肥厚，而LOX-1是ox-LDL的特異性受體。因此，我們通過應(yīng)用LOX-1中和抗體來觀察LOX-1在ox-LDL誘導(dǎo)心肌肥厚中的作用。在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，預(yù)先給予LOX-1中和抗體完全抑制了ox-LDL誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積增大、p-ERK和肥厚基因ANP、SAA的表達。同樣ApoE-/-小鼠給予LOX-1中和抗體也完全抑制了高脂飲食引起ox-LDL升高而誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞橫截面積增大、p-ERK和肥厚基因ANP、SAA的

10、表達。以上結(jié)果表明：ox-LDL通過LOX-1誘導(dǎo)心肌肥厚。
　　研究認(rèn)為RAS參與LOX-1引起的動脈粥樣硬化過程，因此我們進一步研究AngⅡ和AT1在ox-LDL誘導(dǎo)心肌肥厚中的作用。我們利用AT1阻斷劑氯沙坦和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑依那普利進行預(yù)處理心肌細(xì)胞和ApoE-/-小鼠，結(jié)果顯示氯沙坦與LOX-1中和抗體一樣能完全抑制ox-LDL誘導(dǎo)的心肌肥厚。然而，依那普利僅能部分抑制ox-LDL誘導(dǎo)的心肌肥厚，其作用不如氯沙坦。

11、無論是氯沙坦還是依那普利均對ApoE-/-小鼠血壓、心功能和血清ox-LDL無影響，因此我們認(rèn)為ox-LDL/LOX-1也作用于AT1，并且不完全依賴血管緊張素Ⅱ。
　　上述結(jié)果證實了ox-LDL誘導(dǎo)的心肌肥厚與AT1和LOX-1受體有關(guān)
　　第四部分 ox-LDL通過LOX-1和AT1受體直接結(jié)合誘導(dǎo)心肌肥厚
　　我們以上的實驗已經(jīng)發(fā)現(xiàn)LOX-1和AT1-R在心肌肥厚中可能存在相互作用。因此，我們進一步研究LOX-1

12、和AT1-R的關(guān)系。免疫印跡和Real Ttime PCR結(jié)果顯示：無論在蛋白水平，還是在mRNA水平，LOX-1和ATl在ApoE-/-小鼠高脂飲食后表達明顯增高。同樣，在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞給予ox-LDL刺激也引起LOX-1和AT1升高。給予LOX-1中和抗體或氯沙坦顯著逆轉(zhuǎn)ox-LDL刺激引起的LOX-1和AT1升高，但是依那普利僅部分逆轉(zhuǎn)ox-LDL刺激引起的LOX-1和AT1升高。免疫熒光結(jié)果顯示LOX-1(紅色)和AT1(綠

13、色)在ox-LDL刺激的心肌細(xì)胞熒光增強位于細(xì)胞膜，同樣給予LOX-1中和抗體或氯沙坦預(yù)處理，LOX-1(紅色)和AT1(綠色)的熒光明顯減弱。
　　我們開始關(guān)注在ox-LDL誘導(dǎo)心肌肥厚中LOX-1和AT1的相互作用。它們是如何作用的?是直接作用還是間接作用?為了解決以上的問題，我們首先應(yīng)用了免疫共沉淀技術(shù)進行以下的實驗。結(jié)果顯示無論是心肌細(xì)胞還是ApoE-/-小鼠的心肌組織均存在ox-LDL刺激引起LOX-1和AT1結(jié)合，并且

14、明顯高于對照組。給予LOX-1中和抗體或氯沙坦幾乎完全逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象。而依那普利無明顯的逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象的作用。以上的結(jié)果說明ox-LDL刺激引起LOX-1和AT1結(jié)合。我們進一步觀察了LOX-1和AT1是否直接結(jié)合。為了解決以上的問題，我們應(yīng)用了雙分子熒光互補技術(shù)進行以下的實驗。我們構(gòu)建了以下的質(zhì)粒：AT1/KGC：GFP的C端連接到AT1的C端；AT1/KGN：GFP的N端連接到AT1的C端；LOX-1/KGN：GFP的N端連接到LOX-1的

15、N端；LOX-1/KGC：GFP的C端連接到LOX-1的N端；由于只有GFP的N端和C端結(jié)合才能發(fā)綠色熒光，我們將AT1/KGN和LOX-1/KGC或AT1/KGC和LOX-1/KGN共轉(zhuǎn)染入COS7細(xì)胞，然后給予ox-LDL刺激。結(jié)果顯示無論是共轉(zhuǎn)染AT1/KGN和LOX-1/KGC還是共轉(zhuǎn)染AT1/KGC和LOX-1/KGN給予ox-LDL刺激均發(fā)現(xiàn)COS7細(xì)胞發(fā)綠色熒光。由此說明ox-LDL刺激引起LOX-1和AT1直接結(jié)合。

16、r>　　我們認(rèn)為LOX-1和AT1相互作用不依賴于血管緊張素Ⅱ，我們再次應(yīng)用不含血管緊張素原及AT1的COS7細(xì)胞進行一些實驗，轉(zhuǎn)染LOX-1和AT1質(zhì)粒進入COS7細(xì)胞后給予ox-LDL刺激觀察p-ERK的表達。在未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞給予ox-LDL刺激不能引起p-ERK的表達增加，而在單獨轉(zhuǎn)染LOX-1或AT1質(zhì)粒后給予ox-LDL刺激也不能引起p-ERK的表達增加，只有在共同轉(zhuǎn)染LOX-1和AT1質(zhì)粒后給予ox-LDL刺激才能引起p-ER

17、K的表達增加。我們進一步觀察了AT1與LOX-1的作用位點，我們構(gòu)建了AT1的3個突變質(zhì)粒：K199Q、Q257A、C289A，分別與LOX-1共同轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞后給予ox-LDL刺激，觀察p-ERK的表達。結(jié)果顯示Q257A的AT1質(zhì)粒與LOX-1共同轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞后給予ox-LDL刺激不能引起p-ERK的表達增加，而K199Q、C289A與LOX-1共同轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞后給予ox-LDL刺激卻能引起p-ERK的表達增加。以上結(jié)果

18、顯明：AT1的Q257A位點在LOX1和AT1-R的相互作用中起著重要的作用。
　　結(jié)論
　　1.在體、離體ox-LDL均可誘導(dǎo)心肌肥厚。
　　2.ox-LDL誘導(dǎo)的心肌肥厚與LOX-1、AT1直接結(jié)合有關(guān)。
　　3.ox-LDL誘導(dǎo)的心肌肥厚可以被LOX-1中和抗體、AT1阻斷劑氯沙坦完全逆轉(zhuǎn)，而ACE抑制劑依那普利只能部分抑制ox-LDL誘導(dǎo)的心肌肥厚。
　　潛在應(yīng)用價值
　　1.本研究建立的ox