線粒體DNA缺失對ox-LDL誘導巨噬細胞焦亡的影響.pdf

1、背景及目的：線粒體DNA缺失細胞（rho0細胞）是指細胞內不含有線粒體DNA，同時喪失線粒體功能，無法進行氧化呼吸而僅依靠糖酵解供能存活的一類細胞。目前rho0細胞的培養(yǎng)方法主要有溴化乙錠誘導法和質粒轉染誘導。通過制備rho0細胞，可以對線粒體的一些重要功能，如ROS的產生，氧化磷酸化，ATP產生，電子鏈的傳遞等進行研究。
　　細胞焦亡的發(fā)現來自早期研究胞內寄生菌對巨噬細胞作用機制。這種caspase-1依賴的細胞死亡方式不是單核

2、巨噬細胞系所特有的，在樹突狀細胞及其他細胞中均有細胞焦亡的相關報導。各種刺激因素均能夠誘導細胞發(fā)生焦亡，這其中不僅包括病原微生物的病原相關分子模式（PAMP），還包括來自機體自身的損傷相關分子模式（DAMP）。近期文獻報導，動脈粥樣硬化組織樣本的免疫組化顯示，活化的caspase-1在晚期粥樣斑塊中大量表達，同時與巨噬細胞存在共定位關系。體外實驗結果表明，ox-LDL可以通過激活caspase-1分子誘導的巨噬細胞發(fā)生細胞膜溶解性死亡，

3、并伴隨有大量IL-1β和IL-18等細胞因子的釋放?；蚯贸龑嶒炦M一步提示，CD36分子及NLRP3炎癥體亦參與在此過程中。
　　線粒體功能失?？梢杂绊懠毎麑Φ蛲鐾緩降恼{控，在線粒體DNA缺失的多種細胞系中，都表現出對凋亡的抵抗性。但是線粒體及線粒體DNA缺失在ox-LDL誘導的巨噬細胞焦亡中的作用及發(fā)生機制，目前尚不清楚。本研究擬通過制備線粒體DNA缺失的巨噬細胞，進一步探討線粒體在ox-LDL誘導的巨噬細胞焦亡中的作用及機制，

4、為深入研究線粒體在炎癥體活化調控及其在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用打下基礎并提供新的思路。
　　方法：采用含溴化乙錠的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)J774A.1巨噬細胞90d后，采用倒置相差顯微鏡，觀察J774A.1rho0細胞形態(tài)；使用CCK8法檢測細胞在營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中增殖能力；用PCR擴增法觀察線粒體編碼的細胞色素C氧化酶1（cytochromecoxidase1，MtCOI）DNA水平與細胞核編碼的18S核糖體RNA（18SrRNA）的

5、DNA之比；采用SYBRGreen染色法，觀察J774A.1rho0細胞胞內核酸；采用油紅O染色觀察ox-LDL處理后的巨噬細胞內脂滴的聚集情況；采用COD-PAP法檢測ox-LDL處理后的巨噬細胞內總膽固醇水平；采用AO/EB染色及LDH釋放實驗觀察ox-LDL對細胞膜完整性的影響；Westernblot檢測caspase-1及IL-1β的表達；采用DCFH-DA染色，在流式細胞儀上檢測ox-LDL處理前后的J774A.1rho0細胞

6、和J774A.1細胞的胞內ROS產生；采用MitotrackerGreen，MitotrackerDeepRed及DAPI染色，通過激光共聚焦顯微鏡檢測ox-LDL處理前后的J774A.1rho0細胞和J774A.1細胞的線粒體膜電位變化。
　　結果：倒置相差顯微鏡觀察結果表明，J774A.1rho0細胞與J774A.1細胞相比具有明顯形態(tài)學差異；CCK8法檢測結果表明在不含丙酮酸及尿嘧啶的DMEM培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)，J774A.1

7、rho0細胞的增殖受到明顯抑制；溴化乙錠可抑制線粒體DNA的復制，PCR結果顯示J774A.1rho0細胞線粒體編碼的MtCOIDNA水平與細胞核編碼的18SrRNA的DNA比值遠小于J774A.1細胞；SYBRGreen染色結果進一步表明J774A.1rho0細胞胞質的核酸量明顯少于J774A.1細胞；油紅O染色及COD-PAP法檢測結果表明線粒體DNA缺失不影響J774A.1rho0細胞對ox-LDL的攝取及膽固醇在細胞內的聚集；在

8、50、100μg/mlox-LDL分別處理J774A.1rho0細胞及J774A.1細胞24h后，J774A.1rho0細胞組LDH釋放分別為（27.48±3.61）％，（40.94±3.92）%，明顯低于J774A.1細胞組（42.76±6.81）%，（67.3±8.05）%；AO/EB染色的結果顯示，在50、100μg/mlox-LDL作用24h后，視野中橘紅色信號所占比例J774A.1rho0細胞組分別為（23±5.72）%，（2

9、8±11.78）%，明顯低于J774A.1細胞組（45±19.03）%，（81±13.83）%；Westernblot檢測結果表明ox-LDL誘導J774A.1rho0細胞caspase-1及IL-1β的表達水平明顯小于J774A.1細胞；應用DCFH-D染色，流式細胞儀檢測結果顯示J774A.1rho0細胞經過ox-LDL處理后，ROS生成為（58.7±0.84）%小于J774A.1細胞（91.6±0.61）%；激光共聚焦顯微鏡結果表

10、明J774A.1rho0細胞能夠抵抗ox-LDL誘導的線粒體膜電位的下降。
　　結論：
　　1.線粒體DNA缺失的J774A.1細胞可以減少ox-LDL誘導的caspase-1及IL-1β蛋白水平表達，細胞LDH釋放，表明線粒體DNA缺失能夠抵抗ox-LDL誘導的巨噬細胞焦亡。
　　2.線粒體DNA缺失的J774A.1細胞并不影響巨噬細胞攝取ox-LDL及胞內膽固醇的聚集。
　　3.進一步驗證線粒體DNA缺失能夠