線(xiàn)粒體DNA缺失對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡的影響.pdf

1、背景及目的：線(xiàn)粒體DNA缺失細(xì)胞（rho0細(xì)胞）是指細(xì)胞內(nèi)不含有線(xiàn)粒體DNA，同時(shí)喪失線(xiàn)粒體功能，無(wú)法進(jìn)行氧化呼吸而僅依靠糖酵解供能存活的一類(lèi)細(xì)胞。目前rho0細(xì)胞的培養(yǎng)方法主要有溴化乙錠誘導(dǎo)法和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)。通過(guò)制備rho0細(xì)胞，可以對(duì)線(xiàn)粒體的一些重要功能，如ROS的產(chǎn)生，氧化磷酸化，ATP產(chǎn)生，電子鏈的傳遞等進(jìn)行研究。
　　細(xì)胞焦亡的發(fā)現(xiàn)來(lái)自早期研究胞內(nèi)寄生菌對(duì)巨噬細(xì)胞作用機(jī)制。這種caspase-1依賴(lài)的細(xì)胞死亡方式不是單核

2、巨噬細(xì)胞系所特有的，在樹(shù)突狀細(xì)胞及其他細(xì)胞中均有細(xì)胞焦亡的相關(guān)報(bào)導(dǎo)。各種刺激因素均能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡，這其中不僅包括病原微生物的病原相關(guān)分子模式（PAMP），還包括來(lái)自機(jī)體自身的損傷相關(guān)分子模式（DAMP）。近期文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，動(dòng)脈粥樣硬化組織樣本的免疫組化顯示，活化的caspase-1在晚期粥樣斑塊中大量表達(dá)，同時(shí)與巨噬細(xì)胞存在共定位關(guān)系。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ox-LDL可以通過(guò)激活caspase-1分子誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞膜溶解性死亡，

3、并伴隨有大量IL-1β和IL-18等細(xì)胞因子的釋放?；蚯贸龑?shí)驗(yàn)進(jìn)一步提示，CD36分子及NLRP3炎癥體亦參與在此過(guò)程中。
　　線(xiàn)粒體功能失?？梢杂绊懠?xì)胞對(duì)凋亡途徑的調(diào)控，在線(xiàn)粒體DNA缺失的多種細(xì)胞系中，都表現(xiàn)出對(duì)凋亡的抵抗性。但是線(xiàn)粒體及線(xiàn)粒體DNA缺失在ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡中的作用及發(fā)生機(jī)制，目前尚不清楚。本研究擬通過(guò)制備線(xiàn)粒體DNA缺失的巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步探討線(xiàn)粒體在ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡中的作用及機(jī)制，

4、為深入研究線(xiàn)粒體在炎癥體活化調(diào)控及其在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用打下基礎(chǔ)并提供新的思路。
　　方法：采用含溴化乙錠的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)J774A.1巨噬細(xì)胞90d后，采用倒置相差顯微鏡，觀(guān)察J774A.1rho0細(xì)胞形態(tài)；使用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中增殖能力；用PCR擴(kuò)增法觀(guān)察線(xiàn)粒體編碼的細(xì)胞色素C氧化酶1（cytochromecoxidase1，MtCOI）DNA水平與細(xì)胞核編碼的18S核糖體RNA（18SrRNA）的

5、DNA之比；采用SYBRGreen染色法，觀(guān)察J774A.1rho0細(xì)胞胞內(nèi)核酸；采用油紅O染色觀(guān)察ox-LDL處理后的巨噬細(xì)胞內(nèi)脂滴的聚集情況；采用COD-PAP法檢測(cè)ox-LDL處理后的巨噬細(xì)胞內(nèi)總膽固醇水平；采用AO/EB染色及LDH釋放實(shí)驗(yàn)觀(guān)察ox-LDL對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響；Westernblot檢測(cè)caspase-1及IL-1β的表達(dá)；采用DCFH-DA染色，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)ox-LDL處理前后的J774A.1rho0細(xì)胞

6、和J774A.1細(xì)胞的胞內(nèi)ROS產(chǎn)生；采用MitotrackerGreen，MitotrackerDeepRed及DAPI染色，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)ox-LDL處理前后的J774A.1rho0細(xì)胞和J774A.1細(xì)胞的線(xiàn)粒體膜電位變化。
　　結(jié)果：倒置相差顯微鏡觀(guān)察結(jié)果表明，J774A.1rho0細(xì)胞與J774A.1細(xì)胞相比具有明顯形態(tài)學(xué)差異；CCK8法檢測(cè)結(jié)果表明在不含丙酮酸及尿嘧啶的DMEM培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)，J774A.1

7、rho0細(xì)胞的增殖受到明顯抑制；溴化乙錠可抑制線(xiàn)粒體DNA的復(fù)制，PCR結(jié)果顯示J774A.1rho0細(xì)胞線(xiàn)粒體編碼的MtCOIDNA水平與細(xì)胞核編碼的18SrRNA的DNA比值遠(yuǎn)小于J774A.1細(xì)胞；SYBRGreen染色結(jié)果進(jìn)一步表明J774A.1rho0細(xì)胞胞質(zhì)的核酸量明顯少于J774A.1細(xì)胞；油紅O染色及COD-PAP法檢測(cè)結(jié)果表明線(xiàn)粒體DNA缺失不影響J774A.1rho0細(xì)胞對(duì)ox-LDL的攝取及膽固醇在細(xì)胞內(nèi)的聚集；在

8、50、100μg/mlox-LDL分別處理J774A.1rho0細(xì)胞及J774A.1細(xì)胞24h后，J774A.1rho0細(xì)胞組LDH釋放分別為（27.48±3.61）％，（40.94±3.92）%，明顯低于J774A.1細(xì)胞組（42.76±6.81）%，（67.3±8.05）%；AO/EB染色的結(jié)果顯示，在50、100μg/mlox-LDL作用24h后，視野中橘紅色信號(hào)所占比例J774A.1rho0細(xì)胞組分別為（23±5.72）%，（2

9、8±11.78）%，明顯低于J774A.1細(xì)胞組（45±19.03）%，（81±13.83）%；Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明ox-LDL誘導(dǎo)J774A.1rho0細(xì)胞caspase-1及IL-1β的表達(dá)水平明顯小于J774A.1細(xì)胞；應(yīng)用DCFH-D染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示J774A.1rho0細(xì)胞經(jīng)過(guò)ox-LDL處理后，ROS生成為（58.7±0.84）%小于J774A.1細(xì)胞（91.6±0.61）%；激光共聚焦顯微鏡結(jié)果表

10、明J774A.1rho0細(xì)胞能夠抵抗ox-LDL誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體膜電位的下降。
　　結(jié)論：
　　1.線(xiàn)粒體DNA缺失的J774A.1細(xì)胞可以減少ox-LDL誘導(dǎo)的caspase-1及IL-1β蛋白水平表達(dá)，細(xì)胞LDH釋放，表明線(xiàn)粒體DNA缺失能夠抵抗ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡。
　　2.線(xiàn)粒體DNA缺失的J774A.1細(xì)胞并不影響巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL及胞內(nèi)膽固醇的聚集。
　　3.進(jìn)一步驗(yàn)證線(xiàn)粒體DNA缺失能夠