α1A和AT1受體通過特定PCK亞型調(diào)節(jié)hERG鉀通道的分子基礎(chǔ).pdf

1、心律失常，尤其是嚴(yán)重的室性心律失常，是致心血管病患者死亡的主要原因之一。揭示心律失常發(fā)生的細(xì)胞分子機(jī)制，對于心血管疾病治療有重要意義。先天遺傳基因改變或后天獲得性因素引起心肌離子通道的結(jié)構(gòu)和/或功能紊亂是產(chǎn)生心律失常的重要分子基礎(chǔ)[1-5]。其中獲得性離子通道功能的改變與神經(jīng)體液系統(tǒng)的過度激活（特別是交感腎上腺素和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)）密切相關(guān)。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，腎上腺素α1A受體和血管緊張素Ⅱ(AngⅡ) AT1受體可調(diào)節(jié)心肌

2、細(xì)胞膜上的離子通道功能，是心血管疾病病理情況下通道功能異常的重要原因[6-10]。
　　蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)作為細(xì)胞功能調(diào)控的重要分子，中介多種神經(jīng)體液因子作用，在離子通道功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[11-19]。依據(jù)PKC結(jié)構(gòu)與激活機(jī)制分為三類:傳統(tǒng)型PKC（cPKC，包括α、βⅠ、βⅡ和γ），新型PKC（nPKC，包括δ、ε、π和θ），非典型PKC（aPKC，包括ζ、ι/λ）。已知不同動(dòng)物種屬的心

3、肌組織均存在PKCα、βⅠ、βⅡ、γ、ε、θ、δ等亞型，尤其富含PKCα和PKCε亞型[20-22]。有研究表明，對通道動(dòng)力學(xué)不同的調(diào)控方式提示可能不同的PKC亞型中介兩種G蛋白偶聯(lián)受體的作用[23-30]，腎上腺素α1A受體和血管緊張素Ⅱ(AngⅡ) AT1受體激動(dòng)均可通過PKC信號通路調(diào)控心臟HERG鉀通道功能[24,31-33]。
　　因此，本研究主要用分子生物學(xué)方法，在穩(wěn)定表達(dá)HERG鉀通道的HERG-HEK293細(xì)胞，以

4、及成年豚鼠心臟，分給予A61603（α1A受體激動(dòng)劑）、AngⅡ(AT1受體激動(dòng)劑)，測定受體激動(dòng)后不同亞型磷酸化PKC含量變化（PKC自身的磷酸化為其活化的表現(xiàn)），確定PKC激動(dòng)的亞型特異性。利用免疫共沉淀(CoIP)方法進(jìn)一步分析激活的PKCε、PKCα與HERG鉀通道的空間關(guān)系，為兩種G蛋白偶聯(lián)受體通過不同亞型PKC調(diào)節(jié)HERG鉀通道功能提供分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　目的:
　　利用特異性磷酸化PKC抗體檢測α1A和A

5、T1受體激動(dòng)后不同PKC亞型的活化以及其與HERG鉀通道的關(guān)系
　　方法:
　　在穩(wěn)定表達(dá)HERG鉀通道cDNA的HERG-HEK293細(xì)胞上瞬轉(zhuǎn)α1A或AT1受體后，分別加入A61603或AngⅡ10分鐘后，提細(xì)胞膜蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5％BSA封閉液封閉2小時(shí)后，依次加入特異性p-PKCα（磷酸化PKCα抗體），p-PKCε（磷酸化PKCε抗體）和GAPDH（內(nèi)參蛋白）一抗過

6、夜后，洗膜孵熒光二抗，用Odyssey9120雙色紅外激光成像系統(tǒng)儀器掃描，分析蛋白條帶，檢測目的蛋白表達(dá)的變化。目的蛋白的相對含量以目的蛋白與其GAPDH的灰度值比值表示，并均以對照組的灰度比值1，計(jì)算出給藥后目的蛋白表達(dá)量的變化。用OriginPro7.5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)用n表示。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間數(shù)據(jù)比較，當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　使用豚鼠左心室心肌組織重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)

7、。完整豚鼠心臟快速取出后，置Langendorff灌流裝置，臺(tái)氏液灌流待穩(wěn)定后，灌流A61603或AngⅡ10,分鐘，提取左心室組織膜蛋白做Western Blot，檢測磷酸化PKCα和PKCε含量，數(shù)據(jù)處理同上。為驗(yàn)證磷酸化PKCα和PKCε與HERG鉀通道的關(guān)系，做免疫共沉淀(CoIP)實(shí)驗(yàn)。依次完成裂解，沉淀，預(yù)清除，抗體混懸過夜，加瓊脂糖珠，洗脫等步驟，將所得蛋白液進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)，檢測HERG鉀通道蛋白，p-P

8、KCα和p-PKCε。
　　結(jié)果:
　　1、α1A和AT1受體激動(dòng)后，不同PKC亞型的活化
　　Western blot結(jié)果顯示，在穩(wěn)態(tài)表達(dá)HERG-HEK293細(xì)胞，α1受體激動(dòng)劑A61603(1μM)處理細(xì)胞明顯提高p-PKCα表達(dá)量，約為control組的1.2倍(P＜0.05，n=3)，p-PKCα含量變化與PKC激動(dòng)劑PMA相近，然而，A61603并不影響p-PKCε的含量;豚鼠心臟灌流A61603后，p-P

9、KCα蛋白含量為control組的1.1(P＜0.05，n=3)倍;p-PKCε含量雖有變化，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上實(shí)驗(yàn)表明，α1A受體激動(dòng)劑可選擇性激活PKCα亞型。
　　HERG-HEK293細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)AT1受體，加入AngⅡ(100nM)孵育后，Western blot結(jié)果顯示p-PKCα含量約為control組的1.2倍(P＜0.05，n=3)，p-PKCε蛋白含量約為control組的1.2倍，表達(dá)變化與PMA相近;豚鼠心臟

10、灌流AngⅡ后，左心室組織膜蛋白p-PKCα蛋白含量約為control組的1.2倍(P＜0.05，n=3)，p-PKCε蛋白含量為control組的1.3倍(P＜0.05，n=3)，AngⅡ?qū)-PKCα，p-PKCε蛋白表達(dá)的變化均與PMA相似。以上實(shí)驗(yàn)表明，AT1受體激動(dòng)劑可以選擇性的激動(dòng)PKCα和PKCε，且對PKCε的激動(dòng)作用更強(qiáng)。
　　2、激活的PKCα和PKCε與hERG鉀通道的相互關(guān)系。
　　豚鼠心臟灌流A61

11、603或AngⅡ后，左心室組織做CoIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證蛋白-蛋白相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用特異性抗體免疫沉淀HERG蛋白后，Western blot顯示p-PKCα和p-PKCε蛋白條帶均呈陽性;提示p-PKCα、p-PKCε與HERG通道共定位在細(xì)胞膜上。
　　結(jié)論:
　　1、α1A受體激動(dòng)劑可以選擇性的激動(dòng)PKCα;而對PKCε，α1A受體激動(dòng)劑未見明顯作用;AT1受體激動(dòng)劑可以同時(shí)激動(dòng)PKCα與PKCε，但激動(dòng)程度有一定差異