熊果酸通過SIRT1-Atg5激活自噬對ox-LDL誘導HUVECs氧化損傷的保護作用.pdf

1、目的：復制ox-LDL（100μg/ml）誘導的HUVECs氧化損傷模型，并從熊果酸通過Sirt1/Atg5上調自噬抵抗ox-LDL所致HUVECs氧化應激的角度探討其保護作用機制。
　　方法：以體外培養(yǎng)的HUVECs為實驗對象，建立細胞氧化損傷模型，并篩選出熊果酸最佳預保護時間及作用濃度。實驗分組如下：正常對照組，模型組，熊果酸組，模型+熊果酸組，模型+維生素E組、自噬抑制劑3-MA組及Sirt1抑制劑EX-527組。采用CCK

2、-8法檢測各組細胞存活率；化學酶法檢測細胞H2O2、MDA、SOD、NO及NOS水平；透射電鏡觀察細胞超微結構；ESR自旋捕捉技術同時定量檢測NO及ROS的釋放量；Western blotting檢測Sirt1、LC3B、p62、Atg5蛋白表達；免疫沉淀法檢測乙?；疉tg5蛋白。
　　結果：復制了ox-LDL誘導的HUVECs氧化損傷模型；模型組細胞SOD、NOS、NO水平下降，MDA、H2O2含量增多；而加入5-20μM熊果酸

3、預保護16h后，細胞存活率、SOD、NOS、NO水平上升，MDA、H2O2產生減少，且呈劑量依賴性（P<0.05）。透射電鏡觀察細胞超微結構可見，正常組HUVECs細胞質密度均勻，細胞器形態(tài)正常；模型組細胞質濃縮，可見大量電子致密顆粒，偶見多層膜包繞的泡狀結構；熊果酸組細胞內出現(xiàn)大量自噬相關結構。Western blotting結果表明，ox-LDL損傷24h對Sirt1、LC3B及p62蛋白表達水平無明顯影響（P>0.05）；而單獨熊

4、果酸及熊果酸預保護16h的內皮細胞中Sirt1蛋白表達上調，且均有LC3BⅡ/Ⅰ比值升高并伴隨p62蛋白水平的降低（P<0.05）。加入3-MA或EX-527預孵育2h后，細胞生存率與熊果酸預保護組相比明顯下降（P<0.01）。ESR結果顯示，模型組細胞內NO釋放量顯著下降伴隨ROS釋放量顯著增多，熊果酸預保護16h可逆轉上述趨勢，而3-MA或EX-527會減弱熊果酸的保護作用（P<0.05）。另外，EX-527會使熊果酸預保護組Sir

5、t1蛋白水平及LC3BⅡ/Ⅰ比例明顯下降，p62表達升高；免疫沉淀結果可見，熊果酸預保護16h后，HUVECs內乙?；疉tg5蛋白表達量明顯減少，而加入EX-527后，對應的乙酰化Atg5蛋白則相應增多。
　　結論：100μg/ml的ox-LDL作用24h能夠誘導HUVECs發(fā)生氧化損傷，而5-20μM熊果酸可呈劑量依賴性提高細胞生存率并改善細胞氧化應激，建立了ESR自旋共振捕捉技術同時定量檢測HUVECs內NO和ROS含量的方法