Ox-LDL通過IGF2-NF-κB途徑誘導THP-1巨噬細胞中IL-6的表達.pdf

1、目的：IGF2與動脈粥樣硬化的關系尚不清楚;在THP-1巨噬細胞中，Ox-LDL如何調控NF-κB和IL-6表達的分子機制仍未被完全闡明;Ox-LDL能否通過NF-κB信號通路調控細胞中的IL-6的表達有待進一步研究;前期研究提示IGF2參與調控巨噬細胞中的炎癥反應，然而IGF2影響動脈粥樣硬化的炎癥反應的具體機制有待進一步探究;IGF2是否能夠影響炎癥相關基因NF-κB和IL-6的表達尚未見相關文獻報道;Ox-LDL能否介導IGF2和

2、NF-κB來調控細胞中IL-6的表達尚不清楚。因此Ox-LDL、IGF2、NF-κB和IL-6之間相互作用的關系仍有待進一步探討。本文針對以上問題的研究如下。
　　方法：1、細胞培養(yǎng)
　　THP-1細胞生長于含10％的新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5％CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中加入1％100 U/ml的青霉素和100μg/mL的鏈霉素。取對數(shù)生長期細胞進行實驗，在每次實驗前用100 nM佛波酯孵

3、育THP-1細胞24h，誘導分化形成巨噬細胞，更換培養(yǎng)基后加不同濃度梯度的Ox-LDL孵育48h使其轉化成泡沫細胞。
　　2、Ox-LDL的準備
　　將LDL(200 mg protein/mL; Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)溶液加入含硫酸銅（5 mM free Cu2+）的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中進行氧化，37℃孵育24小時。加入含200mM的乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS溶液終止其氧化

4、反應。然后在37℃下透析48小時以去除Cu2+，最后通過0.45mm的過濾器進行過濾滅菌。LDL的氧化性是通過硫代巴比妥反應物(TBARS)與丙二醛雙（二甲基醇縮醛）(MDA)作為標準。該Ox-LDL中TBARS的含量與LDL中TBARS的含量比是6.03:0.31nmol/100 mg(P＜0.01)。新制備的Ox-LDL保存在50 mMTris-HC1，0.15 M NaCl and2.0 mM EDTA中，其保存的pH為7.4，并

5、在使用前十天之內準備。
　　3、RNA提取和實時熒光定量PCR
　　用TRIzol試劑盒（Invitrogen Corporation，Carlsbad, CA，USA）提取THP-1巨噬細胞的總RNA，將1μg總RNA用反轉錄成20μl cDNA。實時熒光定量PCR在ABI7500FAST儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)上進行，溶解曲線分析表明PCR反應是否特異。以GAPDH

6、的表達量為內參，并以△△Ct法對mRNA的表達進行量。本實驗采用以下的引物序列IGF2正向，5'-GGAACCCACATTGGCCTGA-3';IGF2反向，5'-CCGGCGA GGCAGAATATAACAC-3';NF-κB正向，5'-GCCTCCACAAGGCAG CAAATA-3' NF-κB反向，5'-CACCACTGGTCAG AGACTCGGTAA-3'IL-6正向，5'-AAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTA-

7、3'; IL-6反向，5'-TGTCCTGCAGCCACTGGTTC-3';
　　4、免疫印跡分析
　　采用南京凱基生物科技有限公司的蛋白提取試劑盒提取THP-1巨噬細胞中的蛋白，隨后用其公司的BCA量化蛋白測定試劑盒對蛋白的濃度進行測定。對蛋白提取物定量后向蛋白提取物中加入5X的SDS，混勻并煮沸10分鐘，冷卻后置冰箱待用。采用12％-15％瓊脂糖凝膠電泳分離目的蛋白，按說明書要求依次電泳、轉膜、封閉后以兔多克隆抗IL-6

8、(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，SantaCruz，CA，USA)和兔多克隆抗IGF2、NF-κB(Abcam，Cambridge，MA，USA)一抗孵育過夜，以兔多克隆抗β-actin(Abcam)抗體為內參，洗滌孵育二抗再洗滌后，以化學發(fā)光法顯示條帶，檢測目的蛋白的相對表達量。
　　5、轉染小分子RNA
　　THP-1細胞株接種在6孔板(2×106/孔)中，采用Lipo2000轉染人類IGF

9、2、NF-κB特異性siRNA(IGF2-siRNA、NF-κB-siRNA)和對照siRNA。小分子RNA購買自銳博生物科技公司(Cambridgeshire，UK)。轉染48小時后，Trizol收集并裂解細胞，提取總RNA用于mRNA檢測，收集總蛋白用于免疫印跡的檢測。
　　6、重組質粒的構建
　　從Invitrogen Corporation購買包含IGF2的PCR-XL-TOPO載體和PIRES2-EGFP載體。為了

10、合成含有目的基因IGF2和EGFP的EcoRI-IGF2-IRES-EGFP-XhoI片段，我們隨后將上述購買的兩種載體采用重疊PCR進行連接反應。并將IGF2-IRES-EGFP片段和pcDNA3.1(+)載體連接。測序鑒定正確無誤后，命名為pcDNA3.1-IGF2，用質粒試劑盒提取以備使用。通過脂質體2000將重組質粒轉染到培養(yǎng)的細胞中，轉染48小時后，Trizol收集并裂解細胞，提取總RNA用于mRNA檢測，收集總蛋白用于免疫印

11、跡分析過表達效果。
　　7、ELISA法檢測細胞上清IL-6
　　采用ELISA商業(yè)試劑盒（上海研吉生物有限公司），檢測收集好的細胞培養(yǎng)上清液中IL-6表達水平。所有操作均按照產品說明書步驟完成。將酶標儀檢測波長調成450nm，在10分鐘內檢測吸光值。在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本對應的IL-6濃度值。
　　8、統(tǒng)計處理
　　每組實驗

12、重復3次，采用SPSS13.0軟件(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以x±s表示(SDs)。各基因mRNA的相對表達量、各蛋白免疫印跡分析條帶的相對灰度值比較采用t-檢驗和單因素方差分析。方差分析顯著時進行多重比較，方差齊性采用Bonferroni法。統(tǒng)計結果以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：1、Ox-LDL可濃度依賴性上調THP-1巨噬細胞中IGF2、NF-κB和IL-6的表

13、達。2、IGF2介導Ox-LDL上調THP-1巨噬細胞中NF-κB和IL-6的表達。3、NF-κB介導了Ox-LDL上調THP-1巨噬細胞中IL-6的表達。
　　結論：1、在THP-1巨噬細胞中，Ox-LDL可濃度依賴性上調THP-1巨噬細胞中IGF2、NF-κB和IL-6的mRNA和蛋白表達水平。
　　2、在THP-1巨噬細胞中，過表達IGF2后，Ox-LDL上調NF-κB和IL-6表達的效應更加顯著。采用siRNA干擾技