Ox-LDL通過(guò)IGF2-NF-κB途徑誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞中IL-6的表達(dá).pdf

1、目的：IGF2與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系尚不清楚;在THP-1巨噬細(xì)胞中，Ox-LDL如何調(diào)控NF-κB和IL-6表達(dá)的分子機(jī)制仍未被完全闡明;Ox-LDL能否通過(guò)NF-κB信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞中的IL-6的表達(dá)有待進(jìn)一步研究;前期研究提示IGF2參與調(diào)控巨噬細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)，然而IGF2影響動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究;IGF2是否能夠影響炎癥相關(guān)基因NF-κB和IL-6的表達(dá)尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道;Ox-LDL能否介導(dǎo)IGF2和

2、NF-κB來(lái)調(diào)控細(xì)胞中IL-6的表達(dá)尚不清楚。因此Ox-LDL、IGF2、NF-κB和IL-6之間相互作用的關(guān)系仍有待進(jìn)一步探討。本文針對(duì)以上問(wèn)題的研究如下。
　　方法：1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　THP-1細(xì)胞生長(zhǎng)于含10％的新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中加入1％100 U/ml的青霉素和100μg/mL的鏈霉素。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在每次實(shí)驗(yàn)前用100 nM佛波酯孵

3、育THP-1細(xì)胞24h，誘導(dǎo)分化形成巨噬細(xì)胞，更換培養(yǎng)基后加不同濃度梯度的Ox-LDL孵育48h使其轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞。
　　2、Ox-LDL的準(zhǔn)備
　　將LDL(200 mg protein/mL; Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)溶液加入含硫酸銅（5 mM free Cu2+）的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中進(jìn)行氧化，37℃孵育24小時(shí)。加入含200mM的乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS溶液終止其氧化

4、反應(yīng)。然后在37℃下透析48小時(shí)以去除Cu2+，最后通過(guò)0.45mm的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾滅菌。LDL的氧化性是通過(guò)硫代巴比妥反應(yīng)物(TBARS)與丙二醛雙（二甲基醇縮醛）(MDA)作為標(biāo)準(zhǔn)。該Ox-LDL中TBARS的含量與LDL中TBARS的含量比是6.03:0.31nmol/100 mg(P＜0.01)。新制備的Ox-LDL保存在50 mMTris-HC1，0.15 M NaCl and2.0 mM EDTA中，其保存的pH為7.4，并

5、在使用前十天之內(nèi)準(zhǔn)備。
　　3、RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR
　　用TRIzol試劑盒（Invitrogen Corporation，Carlsbad, CA，USA）提取THP-1巨噬細(xì)胞的總RNA，將1μg總RNA用反轉(zhuǎn)錄成20μl cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在ABI7500FAST儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)上進(jìn)行，溶解曲線分析表明PCR反應(yīng)是否特異。以GAPDH

6、的表達(dá)量為內(nèi)參，并以△△Ct法對(duì)mRNA的表達(dá)進(jìn)行量。本實(shí)驗(yàn)采用以下的引物序列IGF2正向，5'-GGAACCCACATTGGCCTGA-3';IGF2反向，5'-CCGGCGA GGCAGAATATAACAC-3';NF-κB正向，5'-GCCTCCACAAGGCAG CAAATA-3' NF-κB反向，5'-CACCACTGGTCAG AGACTCGGTAA-3'IL-6正向，5'-AAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTA-

7、3'; IL-6反向，5'-TGTCCTGCAGCCACTGGTTC-3';
　　4、免疫印跡分析
　　采用南京凱基生物科技有限公司的蛋白提取試劑盒提取THP-1巨噬細(xì)胞中的蛋白，隨后用其公司的BCA量化蛋白測(cè)定試劑盒對(duì)蛋白的濃度進(jìn)行測(cè)定。對(duì)蛋白提取物定量后向蛋白提取物中加入5X的SDS，混勻并煮沸10分鐘，冷卻后置冰箱待用。采用12％-15％瓊脂糖凝膠電泳分離目的蛋白，按說(shuō)明書(shū)要求依次電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后以兔多克隆抗IL-6

8、(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，SantaCruz，CA，USA)和兔多克隆抗IGF2、NF-κB(Abcam，Cambridge，MA，USA)一抗孵育過(guò)夜，以兔多克隆抗β-actin(Abcam)抗體為內(nèi)參，洗滌孵育二抗再洗滌后，以化學(xué)發(fā)光法顯示條帶，檢測(cè)目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　5、轉(zhuǎn)染小分子RNA
　　THP-1細(xì)胞株接種在6孔板(2×106/孔)中，采用Lipo2000轉(zhuǎn)染人類IGF

9、2、NF-κB特異性siRNA(IGF2-siRNA、NF-κB-siRNA)和對(duì)照siRNA。小分子RNA購(gòu)買自銳博生物科技公司(Cambridgeshire，UK)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，Trizol收集并裂解細(xì)胞，提取總RNA用于mRNA檢測(cè)，收集總蛋白用于免疫印跡的檢測(cè)。
　　6、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
　　從Invitrogen Corporation購(gòu)買包含IGF2的PCR-XL-TOPO載體和PIRES2-EGFP載體。為了

10、合成含有目的基因IGF2和EGFP的EcoRI-IGF2-IRES-EGFP-XhoI片段，我們隨后將上述購(gòu)買的兩種載體采用重疊PCR進(jìn)行連接反應(yīng)。并將IGF2-IRES-EGFP片段和pcDNA3.1(+)載體連接。測(cè)序鑒定正確無(wú)誤后，命名為pcDNA3.1-IGF2，用質(zhì)粒試劑盒提取以備使用。通過(guò)脂質(zhì)體2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，Trizol收集并裂解細(xì)胞，提取總RNA用于mRNA檢測(cè)，收集總蛋白用于免疫印

11、跡分析過(guò)表達(dá)效果。
　　7、ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清IL-6
　　采用ELISA商業(yè)試劑盒（上海研吉生物有限公司），檢測(cè)收集好的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6表達(dá)水平。所有操作均按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)步驟完成。將酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)調(diào)成450nm，在10分鐘內(nèi)檢測(cè)吸光值。在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本對(duì)應(yīng)的IL-6濃度值。
　　8、統(tǒng)計(jì)處理
　　每組實(shí)驗(yàn)

12、重復(fù)3次，采用SPSS13.0軟件(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示(SDs)。各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量、各蛋白免疫印跡分析條帶的相對(duì)灰度值比較采用t-檢驗(yàn)和單因素方差分析。方差分析顯著時(shí)進(jìn)行多重比較，方差齊性采用Bonferroni法。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1、Ox-LDL可濃度依賴性上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞中IGF2、NF-κB和IL-6的表

13、達(dá)。2、IGF2介導(dǎo)Ox-LDL上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞中NF-κB和IL-6的表達(dá)。3、NF-κB介導(dǎo)了Ox-LDL上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞中IL-6的表達(dá)。
　　結(jié)論：1、在THP-1巨噬細(xì)胞中，Ox-LDL可濃度依賴性上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞中IGF2、NF-κB和IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　2、在THP-1巨噬細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)IGF2后，Ox-LDL上調(diào)NF-κB和IL-6表達(dá)的效應(yīng)更加顯著。采用siRNA干擾技