DJ-1基因表達分析與功能研究及構(gòu)建在多巴胺能神經(jīng)元過表達tTA的基因敲入小鼠.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩102頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)

文檔簡介

1、帕金森病(Parkinson's disease,PD)是僅次于阿爾茨海默病的第二大神經(jīng)退行性疾病。在60歲以上人群中,其發(fā)病率約為1%,在80歲以上人群中這一數(shù)據(jù)上升至4%。帕金森病臨床上的主要特征是運動功能損傷,例如運動遲緩、震顫、肌肉僵直、步態(tài)異常和姿勢不穩(wěn)。帕金森病在病理學(xué)上的主要特征是路易小體形成和黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元選擇性丟失。最近取得的研究進展極大的增強了對帕金森病的理解和認識,這將為帕金森病的治療提供理論依據(jù)。而人類遺傳學(xué)

2、方面的研究進展則使得我們能夠鑒定與家族性帕金森病相關(guān)的致病基因,DJ-1就是通過遺傳學(xué)連鎖分析發(fā)現(xiàn)的第三個家族性PD致病基因,這些重要的發(fā)現(xiàn)為我們研究帕金森病的致病機理及治療帕金森病奠定了堅實的基礎(chǔ)。
   DJ-1屬于ThiJ/PfpI蛋白超家族,DJ-1蛋白在各個物種中比較保守,小鼠DJ-1與人DJ-1的同源性高達90%。DJ-1基因位于人染色體1p36,全長24kb,共有7個外顯子,其中外顯子1A和1B不參與編碼蛋白質(zhì),并

3、且具有兩種剪接方式,2-7號外顯子包含開放閱讀框,其編碼區(qū)全長567bp,編碼含有189個氨基酸殘基、分子量約20kD的DJ-1蛋白。DJ-1基因突變?nèi)绾螌?dǎo)致帕金森病的發(fā)生到目前為止仍不清楚。但越來越多的證據(jù)表明DJ-1基因可能在氧化應(yīng)激、線粒體損傷、泛素蛋白酶體系統(tǒng)以及mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾的調(diào)控中發(fā)揮作用。DJ-1是作為原癌基因被發(fā)現(xiàn)的,而且被證明具有氧化應(yīng)激感應(yīng)器的功能。Northern雜交分析表明,DJ-1mRNA廣泛表達,存在于人

4、體各個組織中,包括腦、心、肝、胰腺、腎、骨骼肌、胎盤中,提示DJ-1具有廣泛的功能。已有研究小組對DJ-1基因在人腦及嚙齒類動物腦中的表達模式做了分析,但是他們的研究結(jié)果存在很大的爭議,其中主要的爭議在于DJ-1基因是表達于神經(jīng)元中,還是表達于神經(jīng)膠質(zhì)細胞中,并且DJ-1基因是否表達于多巴胺能神經(jīng)元中。在人腦中,爭議的焦點在于DJ-1基因是表達在神經(jīng)元中還是神經(jīng)膠質(zhì)細胞中。在嚙齒類動物腦中,DJ-1是否表達于黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元中仍存在

5、爭議。
   利用DJ-1基因敲除小鼠作為陰性對照,我們研究了DJ-1在成年小鼠大腦中的表達模式和功能。通過原位雜交和免疫組化技術(shù)相結(jié)合,我們在經(jīng)過DJ-1原位雜交的玻片上進行了TH、NeuN和GFAP的免疫組化實驗,我們發(fā)現(xiàn)DJ-1 mRNA在超過96%的神經(jīng)元里表達,而在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中沒有DJ-1mRNA的表達。黑質(zhì)的所有多巴胺能神經(jīng)元均表達DJ-1mRNA。值得一提的是,脈絡(luò)叢和室管膜上皮細胞高表達DJ-1 mRNA。DJ

6、-1廣泛的表達模式提示我們DJ-1具有一些基本的功能。隨后通過免疫組化實驗,我們發(fā)現(xiàn)DJ-1蛋白也不存在于神經(jīng)膠質(zhì)細胞內(nèi),而令人驚奇的是,DJ-1蛋白質(zhì)不存在于神經(jīng)元內(nèi),而且DJ-1的染色是彌漫性的。我們根據(jù)已有的證據(jù)推測DJ-1是通過神經(jīng)元軸突運輸并分泌到細胞外的,通過軸突運輸抑制劑colchicine處理,DJ-1積累在神經(jīng)元內(nèi)。小鼠腦脊液中檢測到了DJ-1的存在。另外大量的DJ-1在小鼠大腦皮層原代神經(jīng)元的培養(yǎng)基中檢測到,這些實驗

7、結(jié)果證實了我們的假設(shè)。
   多巴胺能神經(jīng)元變性死亡和功能異常被認為是帕金森病發(fā)病的主要原因,多巴胺能神經(jīng)元的保護因子和風(fēng)險因子的研究已經(jīng)取得了很大的進展,但是到目前為止,我們很難在動物體內(nèi)闡明這些因子的作用。在這一方面,我們已經(jīng)取得了一些研究進展,就是在多巴胺能神經(jīng)元中特異的敲除感興趣的基因。在過去的幾年時間里,我們致力于研究在一種可調(diào)控的模式下,在多巴胺能神經(jīng)元中過表達任意一個感興趣的基因?;谶@些前期研究,我們計劃利用一種

8、新的策略來實現(xiàn)這個目標,這個實驗的基本思想是將一個正反饋作用元件基因打靶到多巴胺能神經(jīng)元特異性的啟動子之后,從而實現(xiàn)選擇性的在多巴胺能神經(jīng)元中過表達感興趣的基因,這個正反饋作用元件將作為擴增子來促進目的基因的大量表達。正反饋作用原件將利用雙向的tetO啟動子,并作為擴增子加速轉(zhuǎn)基因的表達,多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白(dopamine transporter,DAT)啟動子將控制基因表達的特異性,我們希望此設(shè)計可以實現(xiàn)在多巴胺能神經(jīng)元中特異性、可調(diào)控

9、性的表達感興趣的基因。
   我們構(gòu)建了ES細胞基因打靶載體,順利的進行了ES細胞同源打靶,通過Southern雜交鑒定出了陽性的ES細胞克隆。并且我們對這些陽性的克隆,用5'和3'端的探針重新進行了Southern雜交鑒定。隨后我們準備了ES細胞進行顯微注射,已經(jīng)得到含有tTA和CHR2-mCherry基因的嵌合體小鼠,與C57BL/6雜交后,具有灰色皮膚的雜合子小鼠已經(jīng)長大。這些雜合子小鼠將被用來進行tTA和轉(zhuǎn)基因的表達特異

10、性和表達豐度鑒定,并且我們還將利用doxycycline來調(diào)控這些轉(zhuǎn)基因的表達。
   總之,我們發(fā)現(xiàn)DJ-1mRNA在超過96%的神經(jīng)元里表達,但不在神經(jīng)膠質(zhì)細胞里表達,而且DJ-1在黑質(zhì)的所有多巴胺能神經(jīng)元里都有表達。DJ-1是通過神經(jīng)元軸突運輸并被分泌到細胞外,這提示我們DJ-1在細胞外具有重要的保護神經(jīng)元功能。這一發(fā)現(xiàn)對于最終闡明DJ-1缺失導(dǎo)致帕金森病的發(fā)病機理具有重要意義。我們還構(gòu)建了一個在多巴胺能神經(jīng)元中特異性過表

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論