七氟烷對GAD67-GFP基因敲入小鼠腦內(nèi)GABA神經(jīng)元激活作用及GABAA受體作用的研究.pdf

1、全身麻醉作用機理研究已有160多年的歷史，特別是中樞作用部位，至今仍然是國內(nèi)外麻醉學(xué)界十分關(guān)注而又懸而未決的研究課題。
　　研究目的：本研究目的旨在應(yīng)用分子生物學(xué)、免疫組化及免疫熒光雙標(biāo)等多種先進的神經(jīng)科學(xué)技術(shù)，以GAD67-GFP基因敲入小鼠為研究對象，系統(tǒng)觀察在吸入麻醉藥七氟烷的作用下，腦內(nèi)GABA神經(jīng)元被激活的部位及其GABAA受體參與的部位及細胞內(nèi)機制。為進一步闡明全身麻醉中樞作用機理提供新的證據(jù)。
　　研究方法：<

2、br>　　第一部分：成年雄性GAD67-GFP基因敲入小鼠隨機分為3組：C組(CGroup)空白對照組；S1組(S1Group)：淺麻醉狀態(tài)（Incompleteanesthesiastate）組，即小鼠反正反射消失但不超過30秒；S2組(S2Group)：深麻醉狀態(tài)(Completeanesthesiastate)組，即反正反射完全消失30s以上。各組GAD67-GFP基因敲入小鼠達到預(yù)設(shè)麻醉狀態(tài)后，取腦制取腦薄片（片厚30μm），分

3、別進行Fos免疫組化染色、GABA神經(jīng)元和Fos蛋白的免疫熒光雙標(biāo)染色，在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察計數(shù)；并快速取出GAD67-GFP基因敲入小鼠海馬和丘腦，制備RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計合成c-Fos基因mRNA序列相應(yīng)的特異性引物，實施熒光定量PCR檢測，所有PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
　　第二部分：c57野生小鼠實驗分組同第一部分，設(shè)計合成GABAA受體α4亞單位特異性引物，實施GABAA受體α4亞單位熒光定量P

4、CR檢測，同時進行GABAA受體與Fos免疫熒光雙標(biāo)染色，在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察計數(shù)
　　研究結(jié)果：
　　第一部分：七氟烷對GAD67-GFP基因敲入小鼠腦內(nèi)GABA神經(jīng)元激活作用的研究
　　1.對GAD67-GFP基因敲入小鼠腦內(nèi)Fos蛋白表達的影響結(jié)果表明：吸入麻醉藥七氟烷能誘導(dǎo)GAD67-GFP基因敲入小鼠腦內(nèi)皮質(zhì)（Cg1,Cg2）、海馬(CA1,DG)、下丘腦背內(nèi)側(cè)核(DM)、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG)

5、、丘腦室旁核(PV)、外側(cè)隔核(LS)等部位Fos的表達，與C組相比明顯增多(P<0.05)，隨麻醉深度增加S2組比S1組Fos蛋白表達增多(P<0.05)。還發(fā)現(xiàn)在杏仁核中間部(MeA)、E-W核(E-Wnucleus)、弓狀核(Arc)和下丘腦室旁核腹側(cè)核(PaV)等部位Fos表達僅出現(xiàn)在S2組。
　　2.對GAD67-GFP基因敲入小鼠海馬和丘腦FosmRNA的影響熒光定量PCR結(jié)果表明c-fosmRNA在海馬和丘腦部位S1

6、和S2組表達與對照組相比明顯上調(diào)(P<0.01)，并且S2組上調(diào)更多與S1組相比有顯著差異(P<0.01)。
　　3.對GAD67-GFP基因敲入小鼠腦內(nèi)GABA和Fos共存表達的影響免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果表明：在外側(cè)隔核(LS)幾乎所有的Fos都存在于GABA神經(jīng)元內(nèi)，并且在S2組中共存于GABA神經(jīng)元內(nèi)的Fos與S1組相比明顯增多。在海馬(CA1,DG),下丘腦背內(nèi)側(cè)核(DM),皮質(zhì)(Cg1,Cg2)和中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG),

7、僅有少部分的Fos存在于GABA神經(jīng)元內(nèi)，大部分Fos表達于GABA神經(jīng)元之外。PV有較多的Fos表達，但并沒有GABA神經(jīng)元存在。而在PaV、MeA、Arc及E-W這幾個部位的S2組中也有Fos表達，但是在這幾個神經(jīng)核團中幾乎沒有Fos共存于GABA神經(jīng)元內(nèi)。
　　第二部分：七氟烷對野生c57小鼠腦內(nèi)GABAA受體作用的研究
　　1.對野生c57小鼠腦內(nèi)GABAA受體α4亞單位mRNA表達的影響.在小鼠腦干和丘腦部位GAB

8、AA受體α4亞單位mRNA表達S1和S2組與對照組相比顯著升高(P<0.01)，S2組與S1組相比顯著升高(P<0.01)。
　　2.對野生c57小鼠腦內(nèi)GABAA受體蛋白表達的影響免疫熒光結(jié)果表明：S1和S2組在腦干和丘腦內(nèi)GABAA受體蛋白與Fos蛋白共存表達與對照組相比明顯增加，并且S2組與S1組相比明顯增加(P<0.05)。
　　研究結(jié)論：
　　1．吸入麻醉藥七氟烷能誘導(dǎo)Fos蛋白和c-fosmRNA在GAD6

9、7-GFP基因敲入小鼠腦內(nèi)多個核團神經(jīng)元呈陽性表達，且表達的數(shù)量隨七氟烷麻醉深度增加而增多。
　　2．吸入麻醉藥七氟烷能誘導(dǎo)GAD67-GFP基因敲入小鼠腦內(nèi)相關(guān)核團GABA神經(jīng)元和Fos存在明顯的共存現(xiàn)象，也具有部位差異及顯著的濃度相關(guān)關(guān)系。
　　3．吸入麻醉藥七氟烷能誘導(dǎo)野生c57小鼠腦干和丘腦GABAA受體與Fos共存表達且具有濃度相關(guān)性。
　　以上結(jié)論可證明吸入麻醉藥七氟烷能夠濃度相關(guān)性的激活小鼠腦內(nèi)不同部位的