中國(guó)斗雞cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及DJ-1和ANP基因的表達(dá)研究.pdf

1、中國(guó)斗雞是我國(guó)重要的地方家禽品種資源，育成歷史悠久，馳名中外。中國(guó)斗雞不僅斗性強(qiáng)，具有可觀賞性和娛樂(lè)性，而且肉用性能突出，生長(zhǎng)快，肉質(zhì)鮮美，且具有很好的食補(bǔ)作用，利用價(jià)值頗大。然而，由于以前對(duì)中國(guó)斗雞保護(hù)的不夠，所以造成該品種的數(shù)量銳減。因此，為保護(hù)我國(guó)珍惜的畜禽品種，一種有效的方法就是利用構(gòu)建的cDNA文庫(kù)保存中國(guó)斗雞的功能基因。在本研究中構(gòu)建了中國(guó)斗雞心臟組織cDNA文庫(kù)，成功從文庫(kù)中克隆了DJ-1基因與ANP基因，順利構(gòu)建了DJ-

2、1基因與ANP基因的原核和真核表達(dá)載體，并進(jìn)行原核真核表達(dá)研究。提取中國(guó)斗雞心臟組織總RNA，并對(duì)RNA質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，運(yùn)用SMARTTM技術(shù)成功建成了中國(guó)斗雞心臟組織全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。經(jīng)過(guò)文庫(kù)質(zhì)量鑒定，該文庫(kù)未擴(kuò)增時(shí)滴度為3.32×106pfu/mL，經(jīng)過(guò)宿主菌體外擴(kuò)增后，文庫(kù)的滴度達(dá)到1.01×1010 pfu/mL。為鑒定文庫(kù)中cDNA片段的插入率和片段大小，隨機(jī)挑取文庫(kù)中100個(gè)單克隆菌斑進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示文庫(kù)中cDNA片段

3、的插入率為97.0％，平均插入片段大小約為1.1kb。中國(guó)斗雞cDNA文庫(kù)的建成可以為高通量的篩選本物種的基因和發(fā)現(xiàn)新基因奠定基礎(chǔ)，更重要的是在分子水平對(duì)我國(guó)特有的寶貴畜禽品種的保存具有更長(zhǎng)遠(yuǎn)的意義。
　　 研究中從所建的cDNA文庫(kù)中克隆了DJ-1和ANP基因的CDS區(qū)，并且通過(guò)雙酶切使其定向插入到了原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，通過(guò)設(shè)置不同的IPTG誘導(dǎo)劑濃度和不同的表達(dá)時(shí)間進(jìn)行原核表達(dá)，同時(shí)篩選兩個(gè)融合蛋白的最有表達(dá)條件

4、，與對(duì)照組相比，pGEX-4T-1-DJ-1與pGEX-4T-1-ANP的實(shí)驗(yàn)組在46kD與43.4kD的位置出現(xiàn)DJ-1與ANP融合蛋白的表達(dá)帶，表明DJ-1與ANP基因在BL21菌中表達(dá)成功。
　　 利用相同的雙酶切方法構(gòu)建了DJ-1和ANP基因的四個(gè)真核表達(dá)載體（分別為pEGFP-N3-DJ-1、pEYFP-N1-DJ-1、pDsRedl-N1-DJ-1和pEGFP-N3-ANP）。真核表達(dá)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，將以上四個(gè)重組真

5、核表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入脂尾羊成纖維細(xì)胞中。通過(guò)共聚焦顯微鏡研究這兩個(gè)基因融合蛋白的表達(dá)情況和亞細(xì)胞定位。分別觀察轉(zhuǎn)染24、48和72h后三個(gè)時(shí)期的表達(dá)情況，結(jié)果表明，構(gòu)建的DJ-1和ANP基因的重組載體表達(dá)的重組融合蛋白的轉(zhuǎn)染率分別為12.5％～38.7％之間和17.9％～37.6％之間。DJ-1基因重組融合蛋白在脂尾羊成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)均有分布，而且細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)始終強(qiáng)于細(xì)胞核，轉(zhuǎn)染24h后熒光強(qiáng)度較弱，表達(dá)量較少，48h達(dá)到表達(dá)峰