銀杏內(nèi)生菌纖維素酶的分離、純化及其在銀杏總黃酮提取中的應(yīng)用研究.pdf

1、本文通過(guò)分離銀杏內(nèi)生菌，篩選高產(chǎn)纖維素酶菌株并優(yōu)化產(chǎn)酶條件，建立發(fā)酵液應(yīng)用于銀杏黃酮提取的輔助技術(shù)，同時(shí)，對(duì)銀杏內(nèi)生菌纖維素酶進(jìn)行了分離純化，對(duì)產(chǎn)酶內(nèi)生菌開(kāi)展了分子鑒定，我們的研究為內(nèi)生菌在中藥提取中的應(yīng)用提供了方法和技術(shù)參考。內(nèi)生菌纖維素酶在黃酮提取中的輔助應(yīng)用為我們首次報(bào)道。 首先對(duì)銀杏內(nèi)生菌進(jìn)行了分離純化，共分離出71株菌株，再通過(guò)剛果紅染色及發(fā)酵液酶活測(cè)定最終篩選出1株高產(chǎn)纖維素酶菌株，暫定編號(hào)為Y2菌。篩選和優(yōu)化了真菌

2、Y2的產(chǎn)酶培養(yǎng)基及產(chǎn)酶條件，最終確定培養(yǎng)基：馬鈴薯20％，葡萄糖2％，KH2PO40.3％，MgSO40.15％，維生素B110 mg/L，酵母膏0.5％。發(fā)酵最佳條件：溫度28℃，轉(zhuǎn)速150 rpm，裝液量200 mL/500 mL，該條件下培養(yǎng)6 d后測(cè)定酶活達(dá)4.47 U/mL。 我們對(duì)分離到的活性真菌Y2進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察及分子鑒定，經(jīng)過(guò)玻片小培養(yǎng)、光學(xué)顯微觀察，基本確認(rèn)為青霉屬真菌。為進(jìn)一步了解該菌，又進(jìn)行了DNA的提取

3、及rDNA的ITS(Internal Transcribed Space)區(qū)段分子鑒定，DNA提取采用真菌常用的CTAB法，提取的DNA符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，PCR擴(kuò)增條件經(jīng)過(guò)篩選為：94℃預(yù)變性3 min→94℃40 s52℃1.0 min→72℃1.0 min，30個(gè)循環(huán)后72℃8 min。取5 mL產(chǎn)物于1.5％的瓊脂糖凝膠100 V電泳，在紫外燈下觀察結(jié)果，PCR產(chǎn)物單一，條帶清晰。分子鑒定PCR擴(kuò)增片段，經(jīng)測(cè)序獲得亞基，共564個(gè)堿基

4、，GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast搜索結(jié)果，序列與草酸青霉有100％的同源性，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察確定為草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)。 對(duì)草酸青霉菌纖維素酶進(jìn)一步進(jìn)行了蛋白分離和純化，通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、透析、DEAE-Sephadex A-25陰離子交換層析、Sephadex G-75分子篩凝膠過(guò)濾層析獲得了電泳純的纖維素酶CMCase組分，并對(duì)該組分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行考察。純化后蛋白質(zhì)總量下降了89

5、.87％，總酶活下降了30.65％，酶的比活力達(dá)到466.59 U/mg，提高到原來(lái)的6.67倍，酶的總回收率為10.13％，該酶的分子量約為34.2 kD。該纖維素酶純化組分最佳酶解溫度為50℃，最佳酶解pH為5.0。Fe3+、Fe2+、Al3+離子對(duì)酶活有一定的激活作用，Zn2+、Cu2+、Hg2+對(duì)酶活有很強(qiáng)的抑制作用，在酶的穩(wěn)定性研究中表明該酶最佳保存溫度為低于50℃，最佳保存pH為5.0。該纖維素酶Km值為2.13 mg/mL

6、，Vmax為0.22 mg/mL/min。 建立了HPLC法測(cè)定銀杏總黃酮(槲皮素、山奈酚、異鼠李素)的方法，確定色譜條件：色譜柱為.Agilent C18柱(4.6 mm×250/mm，5μm)；流動(dòng)相為甲醇:0.4％磷酸溶液=59:41；流速為1.0 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為20μL：檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。 我們還研究了銀杏鞣質(zhì)對(duì)纖維素酶活性的抑制，并篩選了去除該類抑制劑的有效吸附劑膠原纖維。同時(shí)，優(yōu)化

7、了纖維素酶發(fā)酵液輔助提取銀杏黃酮的條件，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得出纖維素酶發(fā)酵液酶解銀杏葉的最佳條件為：酶料比15:1加入銀杏干粉中，在pH5.0、溫度50℃下，酶解處理3 h，該條件下的銀杏黃酮提取率達(dá)到了1.33％，比常規(guī)醇提法提高了18.75％。 本研究從銀杏中篩選出一株高產(chǎn)纖維素酶的內(nèi)生菌，經(jīng)分子鑒定為草酸青霉菌。我們分離和純化了草酸青霉纖維素酶，確定了該酶的生化性質(zhì)。通過(guò)該菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化，成功地利用該菌的發(fā)酵液