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文檔簡介
1、目的: 探討NEDD4-1對U251腦膠質瘤細胞中PTEN的作用,揭示AKT和FAK通路在NEDD4-1對膠質瘤細胞凋亡率影響中的作用,為膠質瘤的基因治療提供理論基礎。 方法: 1.構建NEDD4-1shRNA表達質粒,經(jīng)酶切、測序鑒定后擴增。通過脂質體2000分別轉染pcDNA3.1-NEDD4-1、pGPU6/GFP/Neo-NEDD4-1 shRNA及陰性質粒到U251膠質瘤細胞,通過熒光顯微鏡觀察shRNA質粒轉
2、染效率確定最佳時間點。分別采用Western Blot、RT-PCR于轉染后第48 h檢測PTEN的蛋白含量及mRNA水平變化。 2.應用Western Blot分別檢測pcDNA3.1-NEDD4-1轉染U251細胞組、U251細胞組、pGPU6/GFP/Neo-NEDD4-1 shRNA轉染U251細胞三組中AKT和FAK蛋白表達及其磷酸化水平。分別應用FAK競爭性抑制劑FRNK和AKT的特異性阻斷劑Ly294002,采用W
3、estern Blot等方法研究,論證AKT、FAK在NEDD4-1對膠質瘤細胞凋亡影響中的作用。 結果: 1.成功構建NEDD4-1的shRNA表達質粒。經(jīng)穩(wěn)定轉染后,與空白對照組相比,NEDD4-1組PTEN蛋白含量明顯減少(P<0.05),而PTEN mRNA變化不明顯(P>0.05),NEDD4-1干擾組PTEN蛋白含量明顯增加(P<0.05),而PTENmRNA變化不明顯(P>0.05)。 2.應用We
4、stern印跡技術,我們分別檢測了A(pcDNA3.1-NEDD4-1轉染U251細胞組)、B(U251細胞組)、C(NEDD4-1RNAi轉染U251細胞組)三組中AKT和FAK蛋白表達及其磷酸化水平。在檢測的三組細胞中,AKT與FAK蛋白水平無明顯差異。與B組細胞相比,A組細胞中的AKTSer 473位磷酸化程度呈顯著升高,而在C組細胞中則該位點磷酸化程度降低。用FAK Try397抗體檢測發(fā)現(xiàn),A組細胞較B組細胞中的FAK Tyr
5、397位磷酸化程度呈顯著升高,而在C組細胞中則該位點磷酸化程度降低,結合前期實驗結果提示AKT和FAK通路都有可能參與NEDD4-1對膠質瘤細胞的凋亡作用的調控。進一步實驗我們利用轉染FAK抑制劑FRNK質粒來抑制FAK蛋白的磷酸化水平,顯示U251細胞轉染NEDD4-1小干擾質粒后再轉染FRNK質粒24小時后FAK蛋白磷酸化幾乎消失,但NEDD4-1抗凋亡能力并沒有明顯下調。利用Ly294002降低AKT蛋白的磷酸化水平后顯示,轉染p
6、cDNA3.1-NEDD4-1質粒與未轉染質粒的兩組細胞.AKT蛋白磷酸化幾乎消失,并導致了caspase3的激活,但這兩組細胞的凋亡率并沒有因為是否轉染NEDD4-1質粒而有明顯差異,與此形成鮮明對比的是未經(jīng)Ly294002處理的兩組U251細胞(轉染pcDNA3.1-NEDD4-1質粒與未轉染質粒的兩組細胞)的凋亡率卻有明顯差異。 結論: 1.腦膠質瘤細胞中NEDD4-1的異常高表達可通過翻譯后過程阻抑PTEN表達。
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