Src介導(dǎo)NEDD4-1對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖及凋亡的影響.pdf

1、目的: 探討Src介導(dǎo)NEDD4-1在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖及凋亡中的作用。
　　 方法:
　　 1.膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞培養(yǎng)、傳代。
　　 2.根據(jù)siRNA 目的基因序列和載體設(shè)計要求設(shè)計小干擾片段，克隆入pGPu6/GFP/Neo載體，建立Src shRNA表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)，酶切、測序鑒定正確后擴(kuò)增質(zhì)粒。
　　 3. 通過熒光顯微鏡觀察Src+NEDD4-1、NEDD4-1+Src shRNA組和Lipo

2、fectamine 2000脂質(zhì)體以不同比例轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后細(xì)胞存活情況，
　　 4. 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為：空白對照組、NEDD4-1質(zhì)粒組、Src shRNA質(zhì)粒組、Src+NEDD4-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、NEDD4-1+Src shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。通過Lipofectamine 2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率、確定最佳時間點(diǎn)；分別采用Western Blot、RT-PCR檢測Src蛋白含

3、量及mRNA水平變化；通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期；MTT法檢測細(xì)胞增殖；DAPI熒光染色檢測細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果:
　　 1. Src shRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　 2. 脂質(zhì)體與DNA最佳轉(zhuǎn)染效率比例為：3μl:1μg，48 h細(xì)胞存活狀態(tài)最好。
　　 3.與對照組相比，轉(zhuǎn)染Src+NEDD4-1后Src蛋白及mRNA水平上調(diào)，而轉(zhuǎn)染Src shRNA ，NEDD4-1+Src shRNA后Sr

4、c蛋白及mRNA水平均下降。
　　 4. 流式細(xì)胞儀檢測得知：轉(zhuǎn)染Src shRNA ，NEDD4-1+Src shRNA后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞停滯在G0/G1期分別為（70.21±1.89) ％、（69.3±1.82）％，S期分別為(20.1.±2.67) ％ 、(21.9±2.69)；轉(zhuǎn)染Src+NEDD4-1后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞G0/G1期為(19.8±2.79) ％，S期為（70.4±3.21) ％；空白對照組G0/G1 期為(49.

5、5±1.29) ％, S期為(38.9±2.89) ％。
　　 5．MTT法檢測顯示：轉(zhuǎn)染NEDD4-1+Src shRNA組、Src shRNA轉(zhuǎn)染組、Src+NEDD4-1組及NEDD4-1組膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖率分別為：24 h：(91.1±2.47)％、 (89.9±2.79) ％、(111.1±2.12) ％、(110.8±2.01)％；48 h：(80.9±1.04) ％、(80.6±1.03) ％、(121.2±1.39

6、) ％、(120.3±1.44)％；72 h：(60.5±1.82)％、(60.3±1.72) ％、(139.1±2.59) ％、(138.1±2.64) ％；96 h：(49.8±2.73)％、(49.6±2.71) ％、(144.5±4.12) ％、(144.3±4.15) ％。
　　 6．DAPI熒光染色檢測結(jié)果顯示：與空白對照組相比Src+NEDD4-1組膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡減少，Src shRNA組膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡增加。