腦膠質瘤干細胞對Treg細胞和Th17細胞作用機制研究.pdf

1、一、研究背景和目的:
　　 膠質瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，病死率高，嚴重威脅人類健康。膠質瘤的治療方法主要為手術后輔以放療和化療等綜合治療，但總體預后仍不理想，5年生存率低。據(jù)統(tǒng)計，惡性腦腫瘤占人類所有癌癥患者的2％，占兒童全身腫瘤發(fā)病率的20％～25％，綜合發(fā)病年齡高峰在30～40歲，或10～20歲。其中又以膠質細胞瘤發(fā)病率最高，約占惡性腦腫瘤40.49％。膠質母細胞瘤患者從確診開始的中間生存時間是15個月，由于膠質細胞

2、瘤分化不全、且深入神經(jīng)細胞深處，常規(guī)的抗腫瘤措施，包括手術、放療和化療都很難有效根除，導致其復發(fā)率較高。這與膠質瘤本身的生物學特性密切相關。膠質瘤呈浸潤性生長，與周圍正常腦組織之間無明顯界限，手術難以做到將腫瘤全切除，而血腦屏障的存在以及膠質瘤對大部分細胞毒性藥物的高度耐藥使得傳統(tǒng)化療作用也非常有限。盡管顯微手術技術有了很大的進步，手術的安全切除范圍也得到進一步擴大，相關并發(fā)癥有了明顯的下降，術后放療的常規(guī)應用以及新一代的口服化療藥如替

3、莫唑胺的普及在一定程度上提高了患者術后生存期。但這些技術上的進步對于惡性膠質瘤患者的總體預后并無非常明顯的改善，其最大難點仍在于復發(fā)。有鑒于此，惡性膠質瘤的治療和控制一直是神經(jīng)外科臨床和科研工作中的重點和難點內(nèi)容之一，對于其新的輔助治療方法的探索，以期有效抑制或延緩腫瘤復發(fā)具有重要的科學和社會意義。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，在腦膠質瘤中存在一種數(shù)量極少具有干細胞特性的細胞，正是這類細胞導致膠質瘤產(chǎn)生和復發(fā)，這類細胞已經(jīng)被定義為腦腫瘤干細

4、胞(braintumorstemcells，BTSCs)。BTSCs存在于惡性腦膠質瘤的事實最早由Ignatova等（2002年）報道，他們將腦膠質瘤細胞在神經(jīng)干細胞(neuralstemcells，NSCs)培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)有克隆形成，其細胞表達NSCs標志物Nestin，分化細胞則同時或單獨表達神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronespecificenolase，NSE)、神經(jīng)膠質細胞纖維酸性蛋白(glialfibrILl

5、aryacidicprotein，GFAP)和神經(jīng)元β-Ⅲ微管蛋白(neuronalbeta—Ⅲtubulin)等并有基因轉錄，提示這類細胞具有NSCs特性，具有分化為神經(jīng)元樣和膠質細胞樣細胞的能力，因而把這類細胞稱為腫瘤干細胞樣細胞(tumorstem-likecells)，并認為其與腫瘤起源和生長有關。此后，又有Singh等（2004年）發(fā)現(xiàn)，腦腫瘤中幾乎所有的細胞增殖均由一小部分表達人類干細胞標志物CD133的細胞即BTSCs產(chǎn)生

6、。在培養(yǎng)基中，這些細胞可以增殖并分化為神經(jīng)元和（或）膠質細胞，比例、表型與原腫瘤一致。這些新生的腫瘤細胞又可以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生新的腫瘤細胞，證明它們是腫瘤細胞而不是被腫瘤樣本污染的正常NSCs。Hemmati等（2003年）對小兒髓母細胞瘤和膠質瘤進行研究，也發(fā)現(xiàn)存在與NSCs性質相似的細胞，它們在體外可形成神經(jīng)球，能夠自我更新，且具有多分化潛能，在一定環(huán)境中可分化成具有神經(jīng)元和/或膠質細胞表面標志的細胞，細胞比例與原腫瘤相似，提示其參與

7、了腦腫瘤的形成:與正常NSCs不同的是，這些細胞在異體原位移植后，可以分化為與原腫瘤相似表型和核型的腫瘤。
　　 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(RegulatoryT-cells，Treg細胞)是近年來發(fā)現(xiàn)的一群通過細胞間接觸并產(chǎn)生抑制性細胞因子而發(fā)揮免疫負調(diào)控功能的T細胞亞群，1995年由Sakaguchi首次報道。Treg細胞具有低反應性和免疫抑制性兩大功能，對維持機體免疫穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用。Treg細胞在抑制效應性T細胞

8、功能的同時、也降低機體對腫瘤細胞的免疫反應，間接促進腫瘤細胞的生長，在腫瘤細胞免疫逃逸過程中扮演重要角色。在多種惡性腫瘤組織中（如乳腺癌，卵巢癌，肺癌，肝癌，惡性淋巴瘤等）都有大量Treg細胞浸潤，其在患者外周血淋巴細胞中的比例也明顯升高。并且，Treg細胞的數(shù)量與腫瘤的發(fā)展呈正相關、而與腫瘤的預后呈負相關，因此，清除Treg細胞或抑制Treg細胞功能將有助于機體抗腫瘤免疫功能的恢復。叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子(forkhead/win

9、gedhelixtranscriptionfactor,FOXP3)在Treg細胞上特異性表達，是控制Treg發(fā)育及其功能效應的關鍵基因。
　　 Th17細胞則是輔助性T細胞亞群的新成員。Th17細胞最初被發(fā)現(xiàn)于自身免疫性疾病，它們表達CD4和IL-17。初始CD4+T細胞可在TGF-β和IL-6影響下，依賴轉錄因子RORγt而分化為Th17細胞，IL-23，IL-1β等細胞因子也被認為與該亞群細胞分化及功能有關。研究還表明，T

10、h17細胞在感染和自身免疫性疾病中，主要通過表達IL-17及誘導趨化因而誘發(fā)感染和持續(xù)炎癥等病理過程:同時，該群細胞還具有促腫瘤生長的生物學作用，目前已知Th17細胞主要經(jīng)其效應分子IL-17通過以下幾種方式促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展:(1)上調(diào)VEGF、CD31等因子表達，從而促進血管增生，加速腫瘤生長;(2)上調(diào)IL-6、STAT3信號途徑，并由此促進腫瘤進展;(3)下調(diào)Th1表面IL-12Rβ分子表達，從而下調(diào)Th1細胞功能、抵抗有效腫瘤

11、免疫;(4)使CD8+細胞共表達IL-17，從而使CD8+細胞失去細胞毒效應，發(fā)揮抗凋亡作用。
　　 由此可知，BTSCs與腦膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)具有密不可分的關聯(lián)性，而Treg細胞及Th17細胞也通過相關免疫機制或炎性機制而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。那么，在Treg細胞與Th17細胞之間、BTSCs細胞和Treg細胞之間、BTSCs細胞與Th17細胞之間等究竟存在著怎樣的關系？BTSCs是否通過Treg或Treg細胞而導致膠質瘤

12、免疫耐受？
　　 目前的研究發(fā)現(xiàn)，介導免疫耐受的Treg細胞和介導炎癥反應的Th17細胞之間，其功能和分化過程常呈相互對抗狀態(tài)。機體處于正常狀態(tài)下，兩者可保持相對的平衡:一旦出現(xiàn)機體功能異常，則時常表現(xiàn)出Treg/Th17的功能與分化過程失衡。另有研究表明，由活化樹突狀細胞分泌的細胞因子IL-6是決定初始CD4+T細胞向Treg細胞或是Th17細胞方向分化的關鍵因子。還有研究顯示，孤獨核受體RORγt（一種核激素受體超家族成員）

13、是Th17細胞分化中主要的轉錄因子，而Foxp3作為Treg的重要標志性分子，其全長亞型可與RORγt結合從而抑制RORγt的功能、減少RORγt對IL-17在Th17細胞內(nèi)的表達抑制作用。
　　 已知Th17細胞與Treg細胞在相同腫瘤中的數(shù)量呈負相關，表明在腫瘤微環(huán)境中，Th17細胞與Treg細胞存在著相互作用。有報道稱，小鼠周圍神經(jīng)的成熟Treg細胞可被轉化為Th17細胞，尤以感染和IL-6產(chǎn)生過程中容易發(fā)生該類現(xiàn)象。另有

14、報道指出，腫瘤相關Treg細胞表達高水平的CD39，后者是一種外核苷酸酶，可將ATP轉換為腺苷、從而通過腺苷通路抑制Th17細胞的激活。也有報道稱，小鼠Treg細胞可阻止Th17細胞反應。如果Th17細胞介導免疫防御，那么，阻止Th17細胞發(fā)展可逃避免疫系統(tǒng)的防御反應。
　　 目前國內(nèi)外關于膠質瘤、Treg和Th17細胞三者之間的研究還很少，最近的一篇報道表明，膠質瘤內(nèi)Th17和Treg細胞均可以隨著時間的推移而增多，并且Th1

15、7細胞的極化可以通過Treg細胞和膠質瘤微環(huán)境內(nèi)的細胞因子作用完成，提示膠質瘤組織內(nèi)的Th17細胞和Treg細胞均有重要的免疫作用。
　　 既然Treg細胞及Th17細胞之間具有相互作用、并且通過相關免疫機制或炎性機制而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而BTSCs在膠質瘤的發(fā)生發(fā)展中又占有重要的源頭性作用地位（BTSCs通常被認為是膠質瘤的啟動細胞），因此，本研究針對膠質瘤中的BTSCs與同個體Treg或Th17細胞的關系進行了初步探討。我

16、們通過同步分析膠質瘤模型大鼠及膠質瘤標本來源個體的BTSCs特點、這些BTSCs與同個體Treg細胞或Th17細胞特點的相關性，以及在它們并存與否情況下對膠質瘤發(fā)生發(fā)展、惡性度乃至個體生存期的影響等，試圖深入分析BTSCs在膠質瘤相關免疫環(huán)境中所處的作用地位。
　　 二、方法:
　　 本研究分為三部分。
　　 第一部分:BTSCs分離純化及特性
　　 收集術中膠質瘤標本（分級按WHO標準），經(jīng)過剪切修整、

17、常規(guī)胰酶消化等步驟獲取游離的膠質瘤組織細胞，以DMEM/F12培養(yǎng)基加胎牛血清原代培養(yǎng)，至第3～5天取部分原代細胞、并以流式細胞儀檢測其中CD133陽性細胞的表達率。再通過無血清培養(yǎng)法(DMEM/F12培養(yǎng)基加B27、堿性成纖維生長因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)連續(xù)分別培養(yǎng)人原代膠質瘤細胞和大鼠膠質瘤細胞系(9L)，經(jīng)10～20天左右培養(yǎng)出懸浮的腫瘤球（即BTSCs球），再經(jīng)免疫細胞染色和流式細

18、胞檢測等方法，驗證這些腫瘤球表達CD133和Nestin表面標志物的情況。CCK-8檢測這些細胞的生存情況。通過立體定向手術，將大鼠膠質瘤細胞分別移植到F344或Wistar大鼠腦內(nèi)或者皮下，觀察移植后大鼠的生存期和皮下腫瘤生長大小的情況。
　　 第二部分:BTSCs與Treg細胞及其相關細胞因子
　　 在第一部分實驗構建原位膠質瘤動物模型基礎上，以CD4+和CD4+FOXP3+淋巴細胞在外周血的表達率為評估指標，用流式

19、細胞計數(shù)儀、檢測外周血中的Treg細胞含量，并通過酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測外周血細胞因子（如IL-10，IL-6，TGF-β，IFN-γ等）的表達情況。在建立模型后第17天，處死模型鼠，取出膠質瘤組織，制備組織切片，利用免疫組化檢測腫瘤組織中Foxp3、CD133和Nestin的蛋白表達:通過定量PCR的方法檢測腫瘤組織中Foxp3、CD133和Nestin的基因表達。收集人源膠質瘤標本、并抽取患者外周血，在熒光定量PCR檢測腫瘤組

20、織中Foxp3、CD133和Nestin基因表達的同時，同步以流式細胞計數(shù)儀對腦膠質瘤患者外周血單個核細胞中CD4+Foxp3+細胞的含量進行檢測、并評定外周血中Treg細胞的含量。
　　 第三部分:BTSCs與Th17細胞及其相關因子
　　 在第一部分構建原位膠質瘤動物模型的基礎上，通過流式細胞計數(shù)儀檢測模型鼠外周血中CD4+IL17+細胞在CD4+細胞中的表達率，以驗證Th17細胞的陽性率，并通過酶聯(lián)免疫法(ELIS

21、A)檢測外周血中的細胞因子（如IL-17和IL-23等與Th17相關的細胞因子）表達情況。在建立模型后第17天，處死模型鼠，取出膠質瘤組織，制備組織切片，利用免疫組化檢測腫瘤組織中IL-17、CD133和Nestin的蛋白表達:通過定量PCR檢測腫瘤組織中IL-17、CD133和Nestin的基因表達。收集人源膠質瘤標本，并抽取患者外周血，流式細胞計數(shù)儀檢測外周血Th17細胞含量（以CD4+IL17+細胞在CD4+細胞中的百分率為評估指

22、標），同步以熒光定量PCR檢測腫瘤組織中IL-17、CD133和Nestin的基因表達。
　　 統(tǒng)計學處理:全部數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，常規(guī)進行方差齊性檢驗、正態(tài)性檢驗。計量資料實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((x)±SD或mean±SD)表示。生存周期采用Kaplan-Meier方法分析，Cox模型被用于分析膠質瘤患者的病理分級、年齡和性別。單變量兩組資料之間的比較采用t檢驗，多組資料之間的比較采用單因素方差分

23、析，并用LSD法做多重比較，以P＜0.05為統(tǒng)計學有顯著性差異。
　　 三、結果:
　　 1、BTSCs
　　 我們成功地從原代膠質瘤組織中以及9L細胞系中分離出腫瘤細胞球（即BTSCs球），這些BTSCs球均在無血清培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)形成。免疫細胞化學檢測證明，這些腫瘤球均陽性表達CD133和Nestin等BTSCs的標記蛋白（圖1-2）;將這些腫瘤球放入普通血清培養(yǎng)環(huán)境后，腫瘤球貼壁生長，且主要表達GFAP或NS

24、E蛋白（圖1-3）。將普通的大鼠膠質瘤細胞和能形成腫瘤球的膠質瘤細胞分別植入大鼠腦內(nèi)后，觀察發(fā)現(xiàn)，種植腫瘤球的大鼠中位生存時間（22.00±0.557天）要比種植普通膠質瘤細胞的大鼠中位生存時間（27.00±2.309天）短（圖1-6）。同時發(fā)現(xiàn)，種植普通膠質瘤細胞的大鼠的神經(jīng)癥狀如癲癇發(fā)作、偏癱等發(fā)生也較晚。皮下種植膠質瘤的大鼠，在種植后第21天處死，取出腫瘤，經(jīng)測量體積、統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，用腫瘤球種植的大鼠，最后腫瘤的平均體積都較大（

25、平均1665.50±184.304mm3）:而用普通膠質瘤細胞種植的相對較小(平均1218.75±106.456mm3)（圖1-6，表1-4）。對人源膠質瘤標本形成腫瘤球的情況、和患者生存時間同步平行分析后發(fā)現(xiàn)，能在體外培養(yǎng)過程中形成腫瘤球的患者，其生存期較短（圖1-4，表1-2，1-3）。
　　 2、BTSCs和Treg細胞及其相關細胞因子
　　 針對動物標本:ELISA檢測顯示，外周血的IL-10和TGF-β在原位膠

26、質瘤大鼠模型中，相比正常健康對照大鼠，均有顯著差異(圖2-2，2-3)。同時，在外周血TGF-β的表達方面，以普通膠質瘤細胞制備的大鼠模型與由腫瘤球制備的大鼠模型相比，有顯著差異。流式細胞檢測結果表明，正常大鼠的外周血CD4+Foxp3+細胞數(shù)量(6.24±1.832％)，與原位膠質瘤模型鼠的該類細胞數(shù)量(9.82±2.663％)相比有顯著差異。移植普通膠質瘤細胞的模型鼠與移植腫瘤球的模型鼠相比，外周血CD4+Foxp3+細胞的數(shù)量(8

27、.12±2.493％vs.11.52±2.663％)也有顯著差異（圖2-1）。免疫組化檢測表明，在模型鼠腫瘤組織中均有CD4+Foxp3+細胞的存在(圖2-4，2-6)。
　　 針對人源標本:流式細胞檢測顯示，與正常成人對照相比、膠質瘤患者外周血中CD4+Foxp3+細胞的數(shù)量增高(4.640±0.817％vs8.713±2.178％)，二者之間有顯著差異（圖2-8）。定量PCR檢測證實，人膠質瘤組織中存在CD4+Foxp3+細

28、胞，并且膠質瘤組織中Foxp3的表達顯著高于對照組:同時CD133和Nestin的表達，膠質瘤組也顯著高于對照組（圖2-9，2-10）。
　　 3、BTSCs和Th17細胞及其相關細胞因子
　　 針對動物標本:ELISA檢測顯示，外周血的IL-17和IL-23在原位膠質瘤大鼠模型中，相比正常健康對照大鼠，無顯著差異（圖3-2，3-3）。流式細胞檢測結果表明，正常大鼠外周血中CD4+IL-17+細胞在CD4+T細胞亞群中的

29、數(shù)量，與原位膠質瘤模型鼠相比無顯著差異（圖3-1）。免疫組化檢測結果表明，在模型鼠腫瘤組織中均有CD4+IL-17+細胞的存在（圖3-4）。定量PCR也證實了膠質瘤組織中有IL-17的表達。
　　 針對人源標本:流式細胞檢測顯示，與正常成人對照相比、膠質瘤患者外周血中CD4+IL-17+細胞的數(shù)量無顯著差異（圖2-8）。定量PCR檢測結果顯示，人膠質瘤組織中有IL-17的表達，但是與對照組相比兩者差異未見統(tǒng)計學意義(見圖2-9，

30、2-10)。
　　 四、結論:
　　 1、與腫瘤球（BTSCs球）陰性的個體相比，腫瘤球（BTSCs球）陽性的荷膠質瘤大鼠及膠質瘤患者生存期明顯縮短。
　　 2、與腫瘤球(BTSCs球)陰性的個體相比，腫瘤球（BTSCs球）陽性的荷膠質瘤大鼠及膠質瘤病員外周圍血Treg細胞數(shù)量增多，且在隨著BTSCs增多而增多的同時、免疫耐受相關細胞因子TGF-β也顯著升高。
　　 3、與腫瘤球（BTSCs球）陰性的個體