青蒿水提物對(duì)人髓系白血病細(xì)胞株K562的增殖抑制作用及機(jī)理研究.pdf

1、目的: 慢性粒細(xì)胞白血病(CML)是一種起源于多能造血干/祖細(xì)胞惡性增殖性疾病，在我國(guó)發(fā)病率約0.36/10萬(wàn)，占各類白血病的20％。目前治療方法主要以干擾素、骨髓移植、酪氨酸激酶抑制劑為主，但存在費(fèi)用昂貴、骨髓來(lái)源受限、療效不理想、耐藥性等問(wèn)題。從祖國(guó)醫(yī)學(xué)寶庫(kù)中尋找出既能抑制白血病細(xì)胞惡性增殖，副作用相對(duì)較小的天然藥物已成為治療白血病的重要途徑。 青蒿素是傳統(tǒng)中藥分離提取的含特殊過(guò)氧基團(tuán)的倍半萜類化合物，它是被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定

2、為治療惡性瘧疾唯一有效藥物，也是我國(guó)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中為數(shù)不多的被國(guó)際認(rèn)可的一類新藥。近年研究證明：青蒿素的衍生物有150多種，人們僅對(duì)其中幾種衍生物的抗腫瘤作用進(jìn)行了研究，但這些衍生物大多屬于脂溶性或醇溶性藥物，在實(shí)際應(yīng)用中帶來(lái)諸多不變，并且大大影響其用藥效果。據(jù)此，課題組從青蒿中提取到一種水溶性成分，觀察它對(duì)人慢性髓系白血病細(xì)胞株K562、人臍血單個(gè)核細(xì)胞和移植性人白血病模型小鼠的藥理作用，探討其作用機(jī)理，為尋找出具有抗癌活性而毒副作用低的

3、水溶性青蒿素衍生物提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 1.采用MTT比色法檢測(cè)青蒿水提物對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制的作用；光、電鏡下觀察青蒿水提物作用后的K562細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化特征；流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV-FITC加碘化丙啶(PI)雙染定量檢測(cè)在不同濃度、不同時(shí)間作用下青蒿水提物誘導(dǎo)K562細(xì)胞和正常人臍血單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率和脹亡率。 2.采用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)青蒿水提物作用下的K562細(xì)胞膜流動(dòng)性變化；激光掃描共

4、聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)青蒿水提物作用下的K562細(xì)胞內(nèi)游離[Ca2+]變化，細(xì)胞線粒體膜電位變化。 3.采用尾靜脈移植K562細(xì)胞的方法在SCID小鼠建立白血病模型。在成功建立人類移植性白血病模型的基礎(chǔ)上，給予模型小鼠腹腔注射青蒿水提物的治療。通過(guò)比較發(fā)病情況、生存期、外周血象和骨髓象分析，檢測(cè)bcr-abl癌基因的表達(dá)等方面觀察青蒿水提物對(duì)荷瘤小鼠的影響。 結(jié)果; 1.青蒿水提物對(duì)K562細(xì)胞有一定的促進(jìn)分化和明顯

5、的增殖抑制作用，24h、48h、72h的半數(shù)抑瘤濃度IC50(μg/ml)分別為65.17、31.63、10.51。青蒿水提物主要引起K562細(xì)胞的凋亡和脹亡變化，其凋亡率與脹亡率無(wú)明顯差別。一定濃度的青蒿水提物對(duì)臍血單個(gè)核細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用。 2.青蒿水提物可增加K562細(xì)胞膜流動(dòng)性，有明顯量效、時(shí)效關(guān)系；青蒿水提物可使K562細(xì)胞內(nèi)的游離[Ca2+]升高，并有一定劑量依賴性；當(dāng)增加細(xì)胞外液[Ca2+]濃度后，K562細(xì)胞內(nèi)[

6、Ca2+]增加；在細(xì)胞外液中加入鈣離子抑制劑以后，胞內(nèi)[Ca2+]降低。一定濃度的青蒿水提物引起K562細(xì)胞線粒體膜電位的下降。 3.采用尾靜脈移植K562細(xì)胞的方法在SCID小鼠建立白血病模型，接種第四周就可在外周血涂片中觀察到白血病細(xì)胞。在小鼠的肝、脾、腎、外周血、骨髓等檢測(cè)到人白細(xì)胞浸潤(rùn)，部分小鼠有實(shí)體瘤生成。 4.移植性白血病模型小鼠給予青蒿水提物腹腔注射治療，小鼠的一般狀況較對(duì)照組明顯改善，體重較對(duì)照組降低程度

7、變輕，生存期延長(zhǎng)；小鼠的外周血白細(xì)胞數(shù)明顯減少；骨髓象粒細(xì)胞中成熟粒細(xì)胞比例增加；僅在小鼠外周血檢測(cè)有bcr-abl表達(dá)，骨髓細(xì)胞、肝、脾等未檢測(cè)到bcr-abl表達(dá)。 結(jié)論: 1.青蒿水提物對(duì)體外培養(yǎng)的K562細(xì)胞的增殖抑制作用有促進(jìn)細(xì)胞凋亡和脹亡兩種方式，且兩種方式作用比較無(wú)差別。 2.≤50μg/ml濃度的青蒿水提物對(duì)人臍血單個(gè)核細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用。 3.青蒿水提物對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制主要作用于