小檗胺對慢性粒細胞白血病K562格列衛(wèi)耐藥細胞株K562-G01細胞的增殖抑制作用及其機制研究.pdf

1、白血病是一種常見的嚴重危害人類健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一種造血干細胞克隆增殖性疾病,為常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。約95％的CML患者具有Ph染色體,由此產(chǎn)生的p210bcr/abl癌性融合蛋白在CML的發(fā)病中起著十分重要的作用,磷酸化p210bcr/abl癌性融合蛋白可以通過ABL酪氨酸蛋白激酶活性發(fā)揮其促進腫瘤細胞增殖、存活和抑制腫瘤細胞凋亡的生物學功能。格列

2、衛(wèi)(Gleevec,imatinib,STI571)是特異性針對bcr-abl的酪氨酸激酶抑制劑,對Ph+的CML患者具有良好的療效,可使CML患者得到完全或部分血液學和細胞遺傳學緩解,并于2001年獲美國FDA推薦成為Ph+CML的一線藥物。但同年,臨床出現(xiàn)格列衛(wèi)耐藥現(xiàn)象也有報道,由于格列衛(wèi)需要持續(xù)用藥才能維持藥效,出現(xiàn)耐藥性將嚴重影響臨床治療的有效性。因此,尋找新的p210bcr/abl癌性融合蛋白抑制劑仍然十分必要。小檗胺(Ber

3、bamine,BBM)為一種新型的鈣調(diào)素拮抗劑,目前已廣泛用于治療各種原因引起的白細胞減少癥。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),BBM對多種腫瘤細胞如黑色素瘤細胞、前列腺癌細胞、宮頸癌細胞、白血病細胞等均有明顯的增殖抑制作用。我們的研究小組先前的研究也發(fā)現(xiàn),BBM能抑制慢性粒細胞白血病細胞株K562細胞的增殖和誘導其凋亡,并對K562細胞p210bcr/abl癌性融合蛋白的表達有明顯下調(diào)作用。尤其有意義的是BBM對K562細胞格列衛(wèi)耐藥株K562/

4、G01細胞的生長同樣具有明顯的抑制作用,但其作用分子機制仍不十分清楚。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上應(yīng)用體外細胞培養(yǎng)體系,MTT測定細胞活力法、流式細胞術(shù)、RT-PCR、免疫印跡等技術(shù),采用不同濃度BBM處理K562/G01細胞不同時間段后,研究其對K562/實驗細胞為人慢性粒細胞白血病細胞株K562細胞和其格列衛(wèi)耐藥株K562/G01細胞,采用MTT法檢測不同濃度格列衛(wèi)和BBM作用K562、K562/G01細胞24h、48h后的增殖抑制作用

5、,計算格列衛(wèi)和BBM對K562、K562/G01細胞的24、48 h IC50濃度:應(yīng)用Annexin V-FLUOS/PI試劑盒和流式細胞術(shù)定量分析不同濃度BBM(0、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml)作用K562/G01細胞24h后細胞凋亡率;采用半定量RT-PCR方法檢測10μg/ml BBM作用K562/G01細胞不同時間段(0、6h、12h、24h)后BCR/ABL和TCF7、c-MYC、c-JUN等基因mRNA水平

6、的表達;用Western blots免疫印跡法半定量分析8μg/ml、10μg/ml BBM分別作用K562和K562/G01細胞不同時間段(0、6h、12h、24h)后p210bcr/abl總蛋白(c-abl抗體)、磷酸化p210bcr/abl(磷酸化c-abl抗體)蛋白的表達情況:10μg/ml BBM作用K562/G01細胞不同時間段(0、6h、12h、24h)NF-κB(P65抗體)核內(nèi)量、總量和IκB蛋白總量的表達情況。結(jié)果(

7、1)K562/G01細胞對格列衛(wèi)耐藥的檢測:1μg/ml格列衛(wèi)作用于K562細胞和K562/G01細胞48h后抑制率分別為31.82%和91.87%,格列衛(wèi)對K562細胞和K562/G01細胞48h的IC50值分別為0.19μg/ml和3.25μg/ml,K562/G01細胞對格列衛(wèi)耐藥倍數(shù)是K562細胞的17.22倍。(2)BBM對K562細胞和K562/G01細胞的增殖抑制作用:8μg/ml BBM處理K562細胞24、48h后的抑

8、制率分別為53.52%、58.43%。8μg/ml BBM處理K562/G01細胞24、48h后的抑制率分別為36.34%和57.60%,BBM作用K562、K562/G01細胞24h IC50分別為5.02μg/ml和9.07μg/ml;48h的IC50分別為3.28μg/ml和4.43μg/ml。(3)BBM對K562/G01細胞誘導凋亡作用:4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml BBM作用于K562/G01細胞24h后,細胞

9、凋亡率從13.9%分別增加至42.21%、69.30%和79.58%。(4)BBM對K562/G01細胞BCR/ABL融合基因mRNA水平和蛋白水平p210、磷酸化p210表達的影響:8μg/ml BBM和10μg/ml BBM分別處理K562細胞和K562/G01細胞后,K562、K562/G01細胞mRNA水平BCR/ABL融合基因和蛋白水平p210、磷酸化p210表達均有明顯的下調(diào)。K562/G01細胞經(jīng)10μg/ml BBM作用

10、6h后mRNA水平BCR/ABL基因與其β-actin的比值從0.491887降至0.036136,p210含量與其β-actin的比值從0.944降至0.0279,磷酸化p210含量與其β-actin的比值從1.292降至為0。(5)BBM對K562/G01細胞NF-κB(p65)和IκB蛋白表達的影響:10μg/ml BBM處理K562/G01細胞后,核內(nèi)p65的表達量明顯下調(diào),6h后核內(nèi)NF-κB(p65)蛋白與Lamin B的比

11、值從0.382降至0.006;IκB的表達明顯上調(diào),IκB蛋白與其β-actin的比值經(jīng)BBM作用6h后從0.004升至0.163;BBM作用前后K562/G01 NF-κB(p65)細胞總蛋白表達量無明顯改變。(6)10μg/ml BBM作用K562/G01細胞后,mRNA水平TCF7、c-MYC表達明顯受抑,c-JUN mRNA表達上升。其中,TCF7mRNA與β-actin的比值從0h的0.247446降為12h的0.032716

12、;c-MYCmRNA12h時與β-actin的比值為0.211018,而0h時為0.733604;c-JUNmRNA與β-actin的比值0h為0.001173,24h時為0.138436。結(jié)論(1)BBM可以明顯抑制K562、K562/G01白血病細胞的增殖,誘導細胞凋亡。(2)BBM是一種p210bcr/abl蛋白磷酸化抑制劑,能抑制格列衛(wèi)耐藥細胞株K562/G01細胞BCR/ABL基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達,同時也顯示對磷酸化

13、p210蛋白表達有明顯的抑制作用。(3)BBM可下調(diào)K562/G01細胞核內(nèi)NF-κB(p65)蛋白的表達,上調(diào)IκB的含量;下調(diào)TCF7mRNA表達、下調(diào)c-MYC mRNA表達,上調(diào)c-JUN mRNA表達,提示BBM對K562/G01的增殖抑制和誘導凋亡作用可能涉及NF-κB腫瘤信號轉(zhuǎn)導途徑和Wnt腫瘤信號傳導通路。從下調(diào)發(fā)生時間來看,NF-κB(p65)蛋白受到抑制出現(xiàn)在TCF7mRNA水平下降之前,提示小檗胺對K562/G01