小檗胺對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病K562格列衛(wèi)耐藥細(xì)胞株K562-G01細(xì)胞的增殖抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、白血病是一種常見的嚴(yán)重危害人類健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一種造血干細(xì)胞克隆增殖性疾病,為常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。約95％的CML患者具有Ph染色體,由此產(chǎn)生的p210bcr/abl癌性融合蛋白在CML的發(fā)病中起著十分重要的作用,磷酸化p210bcr/abl癌性融合蛋白可以通過ABL酪氨酸蛋白激酶活性發(fā)揮其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、存活和抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的生物學(xué)功能。格列

2、衛(wèi)(Gleevec,imatinib,STI571)是特異性針對(duì)bcr-abl的酪氨酸激酶抑制劑,對(duì)Ph+的CML患者具有良好的療效,可使CML患者得到完全或部分血液學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)緩解,并于2001年獲美國(guó)FDA推薦成為Ph+CML的一線藥物。但同年,臨床出現(xiàn)格列衛(wèi)耐藥現(xiàn)象也有報(bào)道,由于格列衛(wèi)需要持續(xù)用藥才能維持藥效,出現(xiàn)耐藥性將嚴(yán)重影響臨床治療的有效性。因此,尋找新的p210bcr/abl癌性融合蛋白抑制劑仍然十分必要。小檗胺(Ber

3、bamine,BBM)為一種新型的鈣調(diào)素拮抗劑,目前已廣泛用于治療各種原因引起的白細(xì)胞減少癥。近年來國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),BBM對(duì)多種腫瘤細(xì)胞如黑色素瘤細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞等均有明顯的增殖抑制作用。我們的研究小組先前的研究也發(fā)現(xiàn),BBM能抑制慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)其凋亡,并對(duì)K562細(xì)胞p210bcr/abl癌性融合蛋白的表達(dá)有明顯下調(diào)作用。尤其有意義的是BBM對(duì)K562細(xì)胞格列衛(wèi)耐藥株K562/

4、G01細(xì)胞的生長(zhǎng)同樣具有明顯的抑制作用,但其作用分子機(jī)制仍不十分清楚。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)體系,MTT測(cè)定細(xì)胞活力法、流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR、免疫印跡等技術(shù),采用不同濃度BBM處理K562/G01細(xì)胞不同時(shí)間段后,研究其對(duì)K562/實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞和其格列衛(wèi)耐藥株K562/G01細(xì)胞,采用MTT法檢測(cè)不同濃度格列衛(wèi)和BBM作用K562、K562/G01細(xì)胞24h、48h后的增殖抑制作用

5、,計(jì)算格列衛(wèi)和BBM對(duì)K562、K562/G01細(xì)胞的24、48 h IC50濃度:應(yīng)用Annexin V-FLUOS/PI試劑盒和流式細(xì)胞術(shù)定量分析不同濃度BBM(0、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml)作用K562/G01細(xì)胞24h后細(xì)胞凋亡率;采用半定量RT-PCR方法檢測(cè)10μg/ml BBM作用K562/G01細(xì)胞不同時(shí)間段(0、6h、12h、24h)后BCR/ABL和TCF7、c-MYC、c-JUN等基因mRNA水平

6、的表達(dá);用Western blots免疫印跡法半定量分析8μg/ml、10μg/ml BBM分別作用K562和K562/G01細(xì)胞不同時(shí)間段(0、6h、12h、24h)后p210bcr/abl總蛋白(c-abl抗體)、磷酸化p210bcr/abl(磷酸化c-abl抗體)蛋白的表達(dá)情況:10μg/ml BBM作用K562/G01細(xì)胞不同時(shí)間段(0、6h、12h、24h)NF-κB(P65抗體)核內(nèi)量、總量和IκB蛋白總量的表達(dá)情況。結(jié)果(

7、1)K562/G01細(xì)胞對(duì)格列衛(wèi)耐藥的檢測(cè):1μg/ml格列衛(wèi)作用于K562細(xì)胞和K562/G01細(xì)胞48h后抑制率分別為31.82%和91.87%,格列衛(wèi)對(duì)K562細(xì)胞和K562/G01細(xì)胞48h的IC50值分別為0.19μg/ml和3.25μg/ml,K562/G01細(xì)胞對(duì)格列衛(wèi)耐藥倍數(shù)是K562細(xì)胞的17.22倍。(2)BBM對(duì)K562細(xì)胞和K562/G01細(xì)胞的增殖抑制作用:8μg/ml BBM處理K562細(xì)胞24、48h后的抑

8、制率分別為53.52%、58.43%。8μg/ml BBM處理K562/G01細(xì)胞24、48h后的抑制率分別為36.34%和57.60%,BBM作用K562、K562/G01細(xì)胞24h IC50分別為5.02μg/ml和9.07μg/ml;48h的IC50分別為3.28μg/ml和4.43μg/ml。(3)BBM對(duì)K562/G01細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用:4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml BBM作用于K562/G01細(xì)胞24h后,細(xì)胞

9、凋亡率從13.9%分別增加至42.21%、69.30%和79.58%。(4)BBM對(duì)K562/G01細(xì)胞BCR/ABL融合基因mRNA水平和蛋白水平p210、磷酸化p210表達(dá)的影響:8μg/ml BBM和10μg/ml BBM分別處理K562細(xì)胞和K562/G01細(xì)胞后,K562、K562/G01細(xì)胞mRNA水平BCR/ABL融合基因和蛋白水平p210、磷酸化p210表達(dá)均有明顯的下調(diào)。K562/G01細(xì)胞經(jīng)10μg/ml BBM作用

10、6h后mRNA水平BCR/ABL基因與其β-actin的比值從0.491887降至0.036136,p210含量與其β-actin的比值從0.944降至0.0279,磷酸化p210含量與其β-actin的比值從1.292降至為0。(5)BBM對(duì)K562/G01細(xì)胞NF-κB(p65)和IκB蛋白表達(dá)的影響:10μg/ml BBM處理K562/G01細(xì)胞后,核內(nèi)p65的表達(dá)量明顯下調(diào),6h后核內(nèi)NF-κB(p65)蛋白與Lamin B的比

11、值從0.382降至0.006;IκB的表達(dá)明顯上調(diào),IκB蛋白與其β-actin的比值經(jīng)BBM作用6h后從0.004升至0.163;BBM作用前后K562/G01 NF-κB(p65)細(xì)胞總蛋白表達(dá)量無明顯改變。(6)10μg/ml BBM作用K562/G01細(xì)胞后,mRNA水平TCF7、c-MYC表達(dá)明顯受抑,c-JUN mRNA表達(dá)上升。其中,TCF7mRNA與β-actin的比值從0h的0.247446降為12h的0.032716

12、;c-MYCmRNA12h時(shí)與β-actin的比值為0.211018,而0h時(shí)為0.733604;c-JUNmRNA與β-actin的比值0h為0.001173,24h時(shí)為0.138436。結(jié)論(1)BBM可以明顯抑制K562、K562/G01白血病細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。(2)BBM是一種p210bcr/abl蛋白磷酸化抑制劑,能抑制格列衛(wèi)耐藥細(xì)胞株K562/G01細(xì)胞BCR/ABL基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá),同時(shí)也顯示對(duì)磷酸化

13、p210蛋白表達(dá)有明顯的抑制作用。(3)BBM可下調(diào)K562/G01細(xì)胞核內(nèi)NF-κB(p65)蛋白的表達(dá),上調(diào)IκB的含量;下調(diào)TCF7mRNA表達(dá)、下調(diào)c-MYC mRNA表達(dá),上調(diào)c-JUN mRNA表達(dá),提示BBM對(duì)K562/G01的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用可能涉及NF-κB腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和Wnt腫瘤信號(hào)傳導(dǎo)通路。從下調(diào)發(fā)生時(shí)間來看,NF-κB(p65)蛋白受到抑制出現(xiàn)在TCF7mRNA水平下降之前,提示小檗胺對(duì)K562/G01