色胺酮對人白血病細(xì)胞株K562的體內(nèi)外抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、1、研究目的：
　　色胺酮（Tryptanthrin，TRYP），為吲哚喹唑啉類生物堿，化學(xué)名稱為吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮。黃色針晶，熔點267-268°C。最初由馬藍(lán)（Strobilanthes cusia）、蓼藍(lán)（Polygonum tinctorium Lour）、菘藍(lán)（Isatis tinctoria L.）等產(chǎn)藍(lán)植物中得到。文獻(xiàn)報道TRYP具有抗細(xì)菌真菌、抗炎、抗腫瘤及抗寄生蟲等多種藥理活性。但由于TRY

2、P的來源有限，目前國外多集中在TRYP的分離、提取及合成，藥理活性研究多集中在抗炎及少量抗腫瘤等方面。TRYP對血液系統(tǒng)腫瘤的作用也僅局限于對急性早幼粒白血病細(xì)胞的影響，但TRYP對慢性髓系白血病細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期等作用的研究尚未見報道。本課題以仿生合成得到的TRYP為研究試藥，采用體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞和建立體內(nèi)動物模型等方法，探討和揭示TRYP對人白血病細(xì)胞K562的體內(nèi)外抑制作用及其機(jī)制研究，為TRYP的新藥開發(fā)提供實驗依據(jù)。

3、r>　　2、方法：
　　2.1、TRYP對8株人源性腫瘤細(xì)胞的MTT及抑制K562細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的研究：以A549、HepG2、SW480、Eca-109、GRC-1、LNCAP、A375、K562等8株人源性腫瘤細(xì)胞為靶細(xì)胞，以抑制增殖為指標(biāo)，篩選TRYP對腫瘤細(xì)胞株的敏感性，然后以最敏感的腫瘤細(xì)胞為研究對象；同時，確定TRYP對該敏感細(xì)胞體外作用的藥物濃度及作用時間；然后取對數(shù)生長期的細(xì)胞，分別以不同濃度TRYP作用一定時

4、間后，收集細(xì)胞，分別采用相差顯微鏡、Hoechst33258熒光染色法、透射電鏡等方法觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，Annexin-V-FITC和PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；PI單染色檢測細(xì)胞周期的變化。
　　2.2、TRYP對K562細(xì)胞作用機(jī)制研究：Rhdamine123熒光染色進(jìn)行線粒體跨膜電位測定；利用SYBRGreenRT-PCR方法檢測TRYP作用K562細(xì)胞后凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、caspase-3mRNA

5、、融合基因bcr/ablmRNA的表達(dá)變化；Western blot法檢測K562細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Cyt-c、caspase-3及融合蛋白bcr/abl的表達(dá)。
　　2.3、TRYP對小鼠K562白血病的作用及其機(jī)制研究：在體外抗腫瘤實驗研究的基礎(chǔ)上，以荷瘤小鼠為動物模型，觀察TRYP對小鼠K562白血病的作用。采用CTX預(yù)處理，8×106個K562細(xì)胞/鼠尾靜脈接種SCID小鼠建立白血病動物模型；50mg/k

6、g、25mg/kgTRYP灌胃14d，觀察動物的體質(zhì)量，外周血白細(xì)胞數(shù)及其分類和骨髓涂片、bcr/ablmRNA表達(dá)、細(xì)胞周期變化、細(xì)胞表面抗原CD13檢測，并取骨髓、心、肝、脾、肺、腎等重要臟器進(jìn)行病理切片HE染色等，綜合評價TRYP對白血病的治療效果，并探討其可能的作用機(jī)制。
　　3、結(jié)果：
　　3.1、TRYP對腫瘤細(xì)胞的抑制作用研究表明，在A549、HepG2、SW480、Eca-109、GRC-1、LNCAP、A3

7、75、K562等8種人源性腫瘤細(xì)胞中，K562細(xì)胞對TRYP的作用最為敏感，TRYP可明顯抑制K562細(xì)胞增殖，且抑制作用呈現(xiàn)一定的濃度和時間依賴性。TRYP作用48h可誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)和增殖周期發(fā)生明顯改變；相差顯微鏡下，12.5μg/ml、25μg/mlTRYP組，細(xì)胞密度明顯降低，大部分細(xì)胞邊緣不清，亮度減弱，細(xì)胞出現(xiàn)溶解性死亡；透射電鏡可見凋亡細(xì)胞增多，細(xì)胞核固縮，異染色質(zhì)邊集成新月狀或環(huán)狀，甚至壞死；Hoechst33258染色熒

8、光觀察，正常組及溶媒對照組細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則呈彌散均勻的熒光，而TRYP組細(xì)胞胞核內(nèi)出現(xiàn)濃染致密的顆粒塊狀熒光，說明胞核固縮、染色質(zhì)高度凝聚和碎裂。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，TRYP可誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，48h后活細(xì)胞明顯減少，凋亡和死亡細(xì)胞數(shù)明顯上升，處于增殖活躍S期的細(xì)胞比例較對照組明顯降低，尤其是25μg/mlTRYP組作用后，細(xì)胞S期比例降低至33.2％（P<0.01），G0/G1期、G2/M期細(xì)胞比例明顯增高，分別上升至52.6％（P<0

9、.05）、14.3％（P<0.01）。
　　3.2、TRYP抑制K562細(xì)胞的作用機(jī)制以6.25、12.5、25μg/mlTRYP處理K562細(xì)胞48h后，細(xì)胞線粒體跨膜電位呈濃度依賴性下降，細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)降低，而Bax蛋白的表達(dá)增強(qiáng)；胞漿中Cyt-c和細(xì)胞中caspase-3的表達(dá)也逐漸升高。其中以TRYP≥12.5μg/ml時，與空白對照相比作用顯著；此外，25μg/ml TRYP還可抑制融合蛋白bcr/abl表達(dá)。

10、利用SYBRGreenRT-PCR方法檢測上述蛋白在核酸水平的表達(dá)情況與Western blot方法檢測到的結(jié)果較為一致。
　　3.3、TRYP對小鼠白血病的治療作用采用CTX預(yù)注射和尾靜脈接種K562細(xì)胞建立SCID小鼠白血病模型。接種K562細(xì)胞3w后，模型組動物體重明顯減輕并整體呈現(xiàn)惡液質(zhì)，外周血白細(xì)胞數(shù)升高，外周血及骨髓涂片可見中晚幼粒細(xì)胞。經(jīng)50mg/kg、25mg/kg TRYP及180mg/kgHu（陽性對照藥）治療

11、后，小鼠一般狀況比模型組有所改善，體重下降程度輕于模型組。FCM檢測給藥組小鼠與模型組相比骨髓組織中CD13表達(dá)明顯降低（P<0.01）；骨髓中S期細(xì)胞比例下降；病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)給藥后白血病細(xì)胞累及骨髓、脾、肝等臟器所引起的炎癥反應(yīng)有所改善，且50mg/kg組的療效好于25mg/kg組。
　　4、結(jié)論：
　　采用熒光染色、透射電鏡、流式細(xì)胞術(shù)等研究技術(shù)，證實TRYP對人白血病K562細(xì)胞及其誘發(fā)的白血病均具有顯著抑制作用。其可