三氧化二砷與HMBA對白血病K562細胞增殖抑制作用及其分子機制的研究.pdf

1、背景: 1986年，我國學者首先應用全反式維甲酸(alltransretinoicacid，ATRA)誘導分化治療急性早幼粒細胞白血病(acutepromyelocyticleukemia，APL)獲得成功，開創(chuàng)了腫瘤治療史上誘導分化治療最為成功的先例。1992年，我國學者再次發(fā)現(xiàn)應用三氧化二砷(As2O3)治療APL患者，緩解率也高達65％-98％。此后世界各國科學家都在積極研究和開發(fā)新的高效低毒分化誘導劑，同時進行誘導分化劑

2、作用的分子機制研究，以便發(fā)現(xiàn)新的作用靶點。其中組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histonedeacetylaseinhibitor，HDAI)作為一類新的分化誘導劑成為研究的熱點。 紅白血病(AML-M6)是一種少見的異質性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，起源于多能干細胞，可同時累及多個細胞系，臨床預后較差。紅白血病對化療的相對不敏感性及較差的預后，促使人們?nèi)ヌ剿髌錆撛诘脑颉Ｍㄟ^對所建立的紅白血病細胞株K562細胞系的研究，人們發(fā)現(xiàn)以下幾種耐藥的

3、原因：K562細胞系其有抵抗被補體裂解的多重機制；不同紅白血病細胞株K562時脫氧核酸類似物有共同的耐藥機制；多藥耐藥基因(MDR-1)及其產(chǎn)物P糖蛋白的過度表達；p53基因突變。近年來，許多研究表明，誘導分化治療可以通過影響K562細胞特定基因的表達，而可能對紅白血病的治療指明方向。HDAC抑制劑通過增加組蛋白乙?；险{基因表達，盡管受影響的基因不足基因總數(shù)的2％，但卻具有特殊的功效。其中最常受累及的基因包括EVI1、WT1及TGF

4、-β1。 新的分化誘導劑包括HDAI、DNA甲基化抑制劑、蛋白激酶抑制劑(proteinkinaseinhibitors，PKIs)、新的維甲類化合物、環(huán)腺苷酸類衍生物、單克隆抗體、中草藥等。HDAI包括曲古抑菌素A(trichostatinA，TSA)、苯丁酸鈉(sodiumphenylbutyrate，PB)、六亞甲基二乙酰胺(hexamethylenebisacetamide，HMBA)等。HMBA一種平面極性化合物，在體

5、外研究和臨床試驗中對于多種血液腫瘤細胞有一定的治療作用。在我們以前的研究中，已經(jīng)證實HMBA對于多種急性髓細胞性白血病(AML)細胞株有很好的抑制增殖作用，作用機制主要是通過調節(jié)白血病細胞的一些細胞周期相關基因的表達、調節(jié)細胞周期，進而促進白血病細胞分化。HMBA對于CML細胞的作用，目前研究較少，機制也不很明確。通過研究我們發(fā)現(xiàn)，HMBA對于K562細胞有一定作用，可以抑制K562細胞的增殖，抑制的效力和HMBA的濃度有關。As2O3

6、是一種新型的抗白血病藥物，其對急性早幼粒細胞白血病(APL)的治療已取得了顯著療效，目前己廣泛地應用于臨床。國外應用該藥治療慢性白血病取得了明顯療效，國內(nèi)主要應用該藥治療急性早幼粒細胞性白血病，As2O3對急性白血病細胞具有雙重調節(jié)作用，低劑量濃度誘導腫瘤細胞分化，高濃度能誘導腫瘤細胞凋亡，這一特點在APL細胞中最為明顯。體外實驗表明As2O3對NB4細胞表現(xiàn)出劑量依賴的雙重作用，相對高濃度(0.5-2.0μmol/L)可以觸發(fā)凋亡，而

7、在低濃度(0.1-0.5μmol/L)可以誘導部分分化，其機制可能和維甲酸信號通路有關。最近的研究資料表明陽，As2O3對慢性粒細胞性白血病細胞株K562細胞同樣具有生長抑制作用，并能誘導細胞發(fā)生凋亡；此外，As2O3尚能增加耐藥細胞株對化療藥物的敏感性。其機制可能與As2O3可顯著地降低K562細胞端粒酶活性，上調P53蛋白的表達水平有關。 值得注意的是，很多分化誘導劑在治療白血病時還有誘導腫瘤細胞凋亡的作用，也就是說，某些藥

8、物治療白血病的療效并不僅僅是誘導分化在起作用，促進凋亡也起了一定的作用。一方面這種藥物可以促進幼稚的白血病細胞分化為有功能的成熟細胞，另一方面還可以促進幼稚白血病細胞凋亡的發(fā)生，以哪種效果為主似乎與藥物的劑量有密切關系。如果能真正清楚其中的分子機制，對我們高效低毒的使用這些分化誘導劑提供了可能。 目的： 有效的分化誘導劑聯(lián)合誘導分化不僅減低單藥劑量，減少毒副作用和耐藥性，也可增強細胞分化狀態(tài)。兩種或多種分化誘導劑聯(lián)合作用

9、的研究可以為臨床治療中減少副作用和耐藥性、提高緩解率、縮短療程提供有力的理論和實驗基礎。例如ATRA聯(lián)合砷劑治療急性早幼粒白血病患者較單用砷劑可進一步提高療效，CR率達95.1％，并延長緩解期。在這一背景下，世界各國的科學家都在積極尋找新的高效低毒的分化誘導劑，探討聯(lián)合應用分化誘導劑方案。我們通過應用HMBA協(xié)同As2O3作用于K562細胞，觀察其增殖、分化、凋亡及細胞周期的變化，并對其分子機制進行初步探討。 方法： 首

10、先應用HMBA、小劑量As2O3及兩者聯(lián)合應用誘導K562細胞建立分化模型，然后采用MTT實驗測定不同藥物及濃度對細胞增殖的影響，流式細胞術分析細胞周期；RT-PCR方法檢測EVI1及WT1，TGF-β1在mRNA水平的表達的變化。 結果： HMBA以時間劑量依賴性方式抑制K562細胞增殖，與陰性對照組比較，不同濃度HMBA對K562細胞均產(chǎn)生增殖抑制作用。72hHMBA抑制K562細胞的IC50(半數(shù)抑制濃度)約為2m

11、mol/L。1μmol/LAs2O3對K562細胞增殖抑制作用不明顯，兩者聯(lián)用對K562細胞增殖的抑制作用較單用組明顯增強。2mmol/LHMBA及1μmol/LAs2O3誘導K562細胞72h后，均可觀察到G0/G1期細胞百分比升高，G2/M期細胞百分比下降；2mmol/LHMBA處理K562細胞后0h、24h、48h、72h后EVI1及WT1表達降低，條帶逐漸變暗，TGF-β1表達升高，條帶逐漸變亮，1μmol/LAs2O3處理K5

12、62細胞后0h、24h、48h、72h后EVI1及WT1表達降低，條帶逐漸變暗，TGF-β1表達升高，條帶逐漸變亮，其具體分子機制有待進一步研究。 結論： K562細胞經(jīng)HMBA和(或)小劑量As2O3作用72h后，聯(lián)合用藥組較單用藥組能明顯抑制細胞增殖，EVI1及WT1在mRNA水平表達降低，TGF-β1在mRNA水平表達升高，其分子機制可能與EVI1通過抑制TGF-β1/Smad3介導的轉錄而阻止TGF-β1誘導的生