三氧化二砷與HMBA對白血病K562細(xì)胞增殖抑制作用及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、背景: 1986年，我國學(xué)者首先應(yīng)用全反式維甲酸(alltransretinoicacid，ATRA)誘導(dǎo)分化治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(acutepromyelocyticleukemia，APL)獲得成功，開創(chuàng)了腫瘤治療史上誘導(dǎo)分化治療最為成功的先例。1992年，我國學(xué)者再次發(fā)現(xiàn)應(yīng)用三氧化二砷(As2O3)治療APL患者，緩解率也高達(dá)65％-98％。此后世界各國科學(xué)家都在積極研究和開發(fā)新的高效低毒分化誘導(dǎo)劑，同時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)分化劑

2、作用的分子機(jī)制研究，以便發(fā)現(xiàn)新的作用靶點(diǎn)。其中組蛋白去乙?；敢种苿?histonedeacetylaseinhibitor，HDAI)作為一類新的分化誘導(dǎo)劑成為研究的熱點(diǎn)。 紅白血病(AML-M6)是一種少見的異質(zhì)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，起源于多能干細(xì)胞，可同時(shí)累及多個(gè)細(xì)胞系，臨床預(yù)后較差。紅白血病對化療的相對不敏感性及較差的預(yù)后，促使人們?nèi)ヌ剿髌錆撛诘脑?。通過對所建立的紅白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞系的研究，人們發(fā)現(xiàn)以下幾種耐藥的

3、原因：K562細(xì)胞系其有抵抗被補(bǔ)體裂解的多重機(jī)制；不同紅白血病細(xì)胞株K562時(shí)脫氧核酸類似物有共同的耐藥機(jī)制；多藥耐藥基因(MDR-1)及其產(chǎn)物P糖蛋白的過度表達(dá)；p53基因突變。近年來，許多研究表明，誘導(dǎo)分化治療可以通過影響K562細(xì)胞特定基因的表達(dá)，而可能對紅白血病的治療指明方向。HDAC抑制劑通過增加組蛋白乙?；险{(diào)基因表達(dá)，盡管受影響的基因不足基因總數(shù)的2％，但卻具有特殊的功效。其中最常受累及的基因包括EVI1、WT1及TGF

4、-β1。 新的分化誘導(dǎo)劑包括HDAI、DNA甲基化抑制劑、蛋白激酶抑制劑(proteinkinaseinhibitors，PKIs)、新的維甲類化合物、環(huán)腺苷酸類衍生物、單克隆抗體、中草藥等。HDAI包括曲古抑菌素A(trichostatinA，TSA)、苯丁酸鈉(sodiumphenylbutyrate，PB)、六亞甲基二乙酰胺(hexamethylenebisacetamide，HMBA)等。HMBA一種平面極性化合物，在體

5、外研究和臨床試驗(yàn)中對于多種血液腫瘤細(xì)胞有一定的治療作用。在我們以前的研究中，已經(jīng)證實(shí)HMBA對于多種急性髓細(xì)胞性白血病(AML)細(xì)胞株有很好的抑制增殖作用，作用機(jī)制主要是通過調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞的一些細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，進(jìn)而促進(jìn)白血病細(xì)胞分化。HMBA對于CML細(xì)胞的作用，目前研究較少，機(jī)制也不很明確。通過研究我們發(fā)現(xiàn)，HMBA對于K562細(xì)胞有一定作用，可以抑制K562細(xì)胞的增殖，抑制的效力和HMBA的濃度有關(guān)。As2O3

6、是一種新型的抗白血病藥物，其對急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)的治療已取得了顯著療效，目前己廣泛地應(yīng)用于臨床。國外應(yīng)用該藥治療慢性白血病取得了明顯療效，國內(nèi)主要應(yīng)用該藥治療急性早幼粒細(xì)胞性白血病，As2O3對急性白血病細(xì)胞具有雙重調(diào)節(jié)作用，低劑量濃度誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，高濃度能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，這一特點(diǎn)在APL細(xì)胞中最為明顯。體外實(shí)驗(yàn)表明As2O3對NB4細(xì)胞表現(xiàn)出劑量依賴的雙重作用，相對高濃度(0.5-2.0μmol/L)可以觸發(fā)凋亡，而

7、在低濃度(0.1-0.5μmol/L)可以誘導(dǎo)部分分化，其機(jī)制可能和維甲酸信號通路有關(guān)。最近的研究資料表明陽，As2O3對慢性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞同樣具有生長抑制作用，并能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡；此外，As2O3尚能增加耐藥細(xì)胞株對化療藥物的敏感性。其機(jī)制可能與As2O3可顯著地降低K562細(xì)胞端粒酶活性，上調(diào)P53蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。 值得注意的是，很多分化誘導(dǎo)劑在治療白血病時(shí)還有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，也就是說，某些藥

8、物治療白血病的療效并不僅僅是誘導(dǎo)分化在起作用，促進(jìn)凋亡也起了一定的作用。一方面這種藥物可以促進(jìn)幼稚的白血病細(xì)胞分化為有功能的成熟細(xì)胞，另一方面還可以促進(jìn)幼稚白血病細(xì)胞凋亡的發(fā)生，以哪種效果為主似乎與藥物的劑量有密切關(guān)系。如果能真正清楚其中的分子機(jī)制，對我們高效低毒的使用這些分化誘導(dǎo)劑提供了可能。 目的： 有效的分化誘導(dǎo)劑聯(lián)合誘導(dǎo)分化不僅減低單藥劑量，減少毒副作用和耐藥性，也可增強(qiáng)細(xì)胞分化狀態(tài)。兩種或多種分化誘導(dǎo)劑聯(lián)合作用

9、的研究可以為臨床治療中減少副作用和耐藥性、提高緩解率、縮短療程提供有力的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。例如ATRA聯(lián)合砷劑治療急性早幼粒白血病患者較單用砷劑可進(jìn)一步提高療效，CR率達(dá)95.1％，并延長緩解期。在這一背景下，世界各國的科學(xué)家都在積極尋找新的高效低毒的分化誘導(dǎo)劑，探討聯(lián)合應(yīng)用分化誘導(dǎo)劑方案。我們通過應(yīng)用HMBA協(xié)同As2O3作用于K562細(xì)胞，觀察其增殖、分化、凋亡及細(xì)胞周期的變化，并對其分子機(jī)制進(jìn)行初步探討。 方法： 首

10、先應(yīng)用HMBA、小劑量As2O3及兩者聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)K562細(xì)胞建立分化模型，然后采用MTT實(shí)驗(yàn)測定不同藥物及濃度對細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期；RT-PCR方法檢測EVI1及WT1，TGF-β1在mRNA水平的表達(dá)的變化。 結(jié)果： HMBA以時(shí)間劑量依賴性方式抑制K562細(xì)胞增殖，與陰性對照組比較，不同濃度HMBA對K562細(xì)胞均產(chǎn)生增殖抑制作用。72hHMBA抑制K562細(xì)胞的IC50(半數(shù)抑制濃度)約為2m

11、mol/L。1μmol/LAs2O3對K562細(xì)胞增殖抑制作用不明顯，兩者聯(lián)用對K562細(xì)胞增殖的抑制作用較單用組明顯增強(qiáng)。2mmol/LHMBA及1μmol/LAs2O3誘導(dǎo)K562細(xì)胞72h后，均可觀察到G0/G1期細(xì)胞百分比升高，G2/M期細(xì)胞百分比下降；2mmol/LHMBA處理K562細(xì)胞后0h、24h、48h、72h后EVI1及WT1表達(dá)降低，條帶逐漸變暗，TGF-β1表達(dá)升高，條帶逐漸變亮，1μmol/LAs2O3處理K5

12、62細(xì)胞后0h、24h、48h、72h后EVI1及WT1表達(dá)降低，條帶逐漸變暗，TGF-β1表達(dá)升高，條帶逐漸變亮，其具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 結(jié)論： K562細(xì)胞經(jīng)HMBA和(或)小劑量As2O3作用72h后，聯(lián)合用藥組較單用藥組能明顯抑制細(xì)胞增殖，EVI1及WT1在mRNA水平表達(dá)降低，TGF-β1在mRNA水平表達(dá)升高，其分子機(jī)制可能與EVI1通過抑制TGF-β1/Smad3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄而阻止TGF-β1誘導(dǎo)的生