新城疫病毒抑制肝星狀細(xì)胞的活化及其逆轉(zhuǎn)小鼠肝纖維化的研究.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是肝癌中最常見的組織學(xué)類型。在我國70％～90％HCC患者伴有肝硬化。在肝癌發(fā)病率呈上升趨勢的歐美國家，HCC的發(fā)生幾乎全部源于肝硬化的個體。而肝硬化嚴(yán)重影響了HCC治療方法的選擇、療效、并發(fā)癥及預(yù)后。目前認(rèn)為，HCC合并肝硬化的發(fā)病機制基于兩個方面[1]：1）在損傷因子（如：肝炎病毒、黃曲霉素、代謝病和酒精等）存在下，肝細(xì)胞持續(xù)性受損、變性和壞死所致的炎性反應(yīng)以及細(xì)胞

2、外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）合成過多，ECM不能被降解、吸收，從而導(dǎo)致在肝內(nèi)大量沉積，形成肝纖維化，最終則引起以纖維組織環(huán)繞增生肝細(xì)胞團的硬化結(jié)節(jié)，即肝硬化。在這一過程中，肝星狀細(xì)胞（hepaticstellatecell，HSC）由靜止?fàn)顟B(tài)活化為成肌纖維細(xì)胞，大量分泌ECM，是肝纖維化發(fā)生乃至肝硬化進展的主要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。2）在肝纖維化炎性環(huán)境中產(chǎn)生的氧自由基等誘變物質(zhì)引起肝細(xì)胞DNA損傷，損傷的肝細(xì)胞應(yīng)答旁

3、分泌細(xì)胞因子的刺激而增殖，這種不斷的損傷、再生誘發(fā)的多基因變異是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌變的關(guān)鍵。
　　HSC活化是肝纖維化發(fā)生的主要原因，肝纖維化是肝癌前病變的重要病理階段。免疫組化研究顯示，HCC合并肝硬化中活化的HSC數(shù)量顯著增高，而肝癌細(xì)胞分泌的有絲分裂因子也具有促進HSC活化并增殖的作用[2]；活化HSC和癌變細(xì)胞的相互作用會進一步加重肝癌合并肝硬化程度。因此著眼于活化HSC的靶向治療是抑制肝纖維化，改善肝癌狀況的一個新的研究熱點。

4、目前，抑制肝纖維化的途徑主要集中在：阻斷轉(zhuǎn)化生長因子β（transforminggrowthfactorβ，TGF-β）信號通路，以拮抗TGF-β在HSC活化中的作用[3,4]；減少細(xì)胞外基質(zhì)ECM的生成，降解組織中過量沉積的膠原纖維[5,6]。
　　新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）是單股負(fù)鏈RNA病毒，屬副粘病毒科。由于多數(shù)RNA病毒具有天然地在腫瘤細(xì)胞選擇性復(fù)制的特點，近年來用這類病毒作為新型運

5、載工具在腫瘤基因治療方面引起了人們的關(guān)注。另一方面，NDV作為溶瘤病毒用于腫瘤治療已見臨床報道。NDV在腫瘤細(xì)胞選擇性復(fù)制的機制和腫瘤細(xì)胞的干擾素信號通路缺陷有關(guān)[7]。1976年，McGregor報道了NDV能夠在活化的T細(xì)胞中復(fù)制，并導(dǎo)致活化T細(xì)胞的死亡[8]；Fábián最近又報道了NDV能夠在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中高效地復(fù)制[9]?；诨罨疕SC是一種非正常的、具有增殖能力的細(xì)胞，我們提出假設(shè)：NDV能在這種活化的HSC中復(fù)制，并抑制HS

6、C的活化，進而達(dá)到逆轉(zhuǎn)肝纖維化的目的。本論文以抑制活化HSC為出發(fā)點，探討NDV在HSC中的復(fù)制率及其對肝纖維化相關(guān)基因在mRNA和蛋白水平的影響，并通過建立小鼠肝纖維化模型，研究NDV的體內(nèi)逆轉(zhuǎn)肝纖維化的功能。
　　第一部分：NDV在人肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)活化HSC中的復(fù)制
　　目的：探討人肝癌細(xì)胞FHCC-98條件培養(yǎng)基（conditionedmedium,CM）對人肝星狀細(xì)胞LX-2活化的誘導(dǎo)作用；檢測NDV在LX-

7、2細(xì)胞中的復(fù)制率。方法：用不同百分含量的FHCC-98CM刺激LX-2細(xì)胞，MTT法檢測細(xì)胞的增殖率，TGF-β1為陽性對照。半定量及Real-time定量RT-PCR檢測40％CM（V/V）或2ng/mlTGF-β1刺激前后LX-2細(xì)胞中α-平滑肌動蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）、Ⅰ型膠原（collagenⅠ）、金屬蛋白酶組織抑制劑-1（tissueinhibitorofmetalloproteinase-

8、1，TIMP-1）和TGF-β1四種活化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。用攜帶增強型綠色熒光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）的重組NDV（NDFLtag-EGFP）感染不同傳代的LX-2細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察EGFP在細(xì)胞中的表達(dá)率和熒光強度，以反映NDV的復(fù)制率。用流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometry,FACS）定量檢測NDFLtag-EGFP在40％CM或2ng/mlTGF-β1刺激活化的L

9、X-2細(xì)胞中的復(fù)制。結(jié)果：FHCC-98CM和TGF-β1均能夠刺激LX-2細(xì)胞的活化。低濃度的CM（10％～40％）更有利于LX-2細(xì)胞的增殖，40％CM刺激時的細(xì)胞增殖率最大，為25.8％。TGF-β1對LX-2細(xì)胞增殖的影響呈正相關(guān)，且具有劑量依賴性。與無刺激的對照組相比，CM或TGF-β1刺激LX-2細(xì)胞活化后，細(xì)胞中α-SMA、collagenⅠ、TIMP-1和TGF-β1四種基因的表達(dá)均有所增加。NDV隨著LX-2細(xì)胞的連續(xù)

10、傳代，其在細(xì)胞中的復(fù)制率也逐漸增加。FACS顯示，LX-2細(xì)胞分別經(jīng)40％CM和2ng/ml的TGF-β1刺激活化后，NDV在細(xì)胞中的復(fù)制率分別提高了1.76倍和1.52倍。結(jié)論：FHCC-98CM能誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞活化并增殖，NDV在活化LX-2細(xì)胞中的復(fù)制率提高。
　　第二部分：NDV對HSC活化的抑制作用
　　目的：探討NDV在活化HSC中的復(fù)制對HSC的增殖以及細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。方法：用不同滴度的NDV溶瘤株It

11、alien（NDV-Italien）感染經(jīng)CM刺激的LX-2細(xì)胞，MTT法檢測NDV對細(xì)胞增殖率的影響。免疫熒光顯微鏡技術(shù)檢測活化標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)變化。實時定量RT-PCR檢測NDV對四種活化相關(guān)基因α-SMA、collagenⅠ、TIMP-1和TGF-β1mRNA水平的影響。明膠酶譜法檢測MMP-2和MMP-9的分泌。結(jié)果：NDV的感染抑制了LX-2細(xì)胞的增殖，細(xì)胞增殖率和病毒滴度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。與未刺激組相比，NDV在CM刺激的

12、LX-2細(xì)胞中的增殖抑制率提高，四種基因的表達(dá)顯著性下調(diào)，MMP-2和MMP-9的分泌下調(diào)。結(jié)論：NDV在活化LX-2細(xì)胞中的復(fù)制具有抑制細(xì)胞增殖和HSC活化的作用。
　　第三部分：NDV對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的逆轉(zhuǎn)
　　目的：通過體內(nèi)試驗探討NDV對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的抑制作用。方法：體重約20g的昆明小鼠，每周兩次腹腔注射100μlCCl4/花生油溶液（20％,V/V），對照組同時注射100μl生理鹽水（P

13、S），連續(xù)注射8周。最后一次在CCl4注射后3天，尾靜脈注射200μl滴度為1,000HU（hemagglutinationunit）的NDV-Italien1次或每24h間隔連續(xù)注射3次。NDV注射24h后處死動物，取出肝臟進行大體形態(tài)觀察并拍照。肝組織用福爾馬林固定，石蠟包埋，組織切片進行常規(guī)HE染色和Masson三色染色。新鮮肝組織用RIPA（non-ionicdetergent-containingbuffer）裂解液裂解，BC

14、A（bicinchoninicacid）蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度，取50μg總蛋白上樣進行Westernblot檢測α-SMA的表達(dá)。新鮮肝組織進行冰凍切片，冷丙酮固定，免疫熒光雙染法檢測組織中α-SMA和NDV顆粒的表達(dá)和定位。結(jié)果：CCl4誘導(dǎo)8周后，小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的纖維化癥狀，可看到肝組織變硬、表面粗糙不平、密集分布大量的白色點狀斑塊。HE染色顯示，纖維化肝臟的組織結(jié)構(gòu)松散，竇周隙增大。Masson三色染色顯示膠原異常沉積。