蛋白微陣列技術(shù)檢測(cè)抗可提取核抗原抗體診斷試驗(yàn)的初步評(píng)價(jià).pdf

1、背景 結(jié)締組織病(connective tissue disease，CTD)的特征之一是患者體內(nèi)存在多種針對(duì)自身抗原成分的自身抗體，這些抗體與自身免疫損傷發(fā)生的機(jī)理以及疾病的臨床表現(xiàn)有著不同程度的相關(guān)，并且有部分抗體在發(fā)病前幾年即可在血清中檢測(cè)到。目前應(yīng)用在臨床檢驗(yàn)中的自身抗體檢測(cè)項(xiàng)目達(dá)幾十種以上，但每種自身抗體檢測(cè)方法并不統(tǒng)一，同一種自身抗體也往往有兩種以上的檢測(cè)方法。現(xiàn)臨床用于檢測(cè)自身抗體的常用方法有免疫印跡法(IBT)、

2、免疫雙擴(kuò)散法(ID)、對(duì)流免疫電泳(CIE)及部分抗原的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等檢測(cè)手段。不同檢測(cè)方法的敏感性和特異性之間的差異不僅給臨床醫(yī)生帶來困惑，為不同醫(yī)療機(jī)構(gòu)中相互參考檢驗(yàn)結(jié)果帶來障礙，此外，由于這些方法需要大量血清在不同反應(yīng)池進(jìn)行滴度測(cè)定，反復(fù)采樣也給患者帶來身體和經(jīng)濟(jì)上的損失。所以，開發(fā)和研究新的抗體檢測(cè)途徑不僅對(duì)推動(dòng)風(fēng)濕性疾病基礎(chǔ)研究具有重要意義，而且又是臨床和科研的迫切需要。蛋白微陣列不同于上述這些傳統(tǒng)方法，它可以

3、實(shí)現(xiàn)使用微量標(biāo)本同時(shí)篩查不同指標(biāo)。從而不僅節(jié)省了標(biāo)本用量，還可以提高系統(tǒng)性免疫病診斷效率。本文用蛋白微陣列法分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)血清、連續(xù)常規(guī)送檢的血清標(biāo)本、正常人及診斷明確患者血清進(jìn)行了抗可提取核抗原(extr。actable nuclear。antigen，ENA)抗體檢測(cè)，并與ID、ELISA方法比較，來評(píng)價(jià)蛋白芯片方法的敏感度、特異度和診斷準(zhǔn)確性。 目的： 1．初步評(píng)價(jià)蛋白微陣列方法檢測(cè)抗ENA抗體的準(zhǔn)確性。 2．

4、比較蛋白微陣列方法與ID(金標(biāo)準(zhǔn))檢測(cè)抗ENA抗體結(jié)果，計(jì)算蛋白微陣列方法的敏感度、特異度、符合率。 3．評(píng)價(jià)蛋白微陣列方法檢測(cè)抗ENA抗體同其他常用方法(ID法、ELISA法)的一致性。 4．比較三種方法檢測(cè)抗ENA抗體在不同結(jié)締組織病中的陽性率。 材料與方法： 實(shí)驗(yàn)對(duì)象：1、衛(wèi)生部臨檢中心的抗ENA抗體標(biāo)準(zhǔn)血清10份；2、風(fēng)濕免疫科實(shí)驗(yàn)室常規(guī)送檢血清1580份；3、獻(xiàn)血員血清300份；4、診斷明確患者

5、血清445份，其中包括多發(fā)性肌炎/皮肌炎22份、系統(tǒng)性硬化48份、系統(tǒng)性紅斑狼瘡135份、原發(fā)干燥綜合征95份、其他結(jié)締組織病72份、非結(jié)締組織病73份。 實(shí)驗(yàn)方法：1、蛋白微陣列法：用噴點(diǎn)點(diǎn)樣儀將純化抗原在經(jīng)過化學(xué)修飾的96孔微量滴定板孔內(nèi)點(diǎn)制抗原微陣列。然后包被、洗板、封閉、加樣孵育、化學(xué)發(fā)光、信號(hào)提取數(shù)據(jù)處理。用蛋白微陣列法盲法檢測(cè)臨檢中心的標(biāo)準(zhǔn)血清，比對(duì)結(jié)果。2、ID法：經(jīng)對(duì)流免疫電泳和免疫印跡法并聯(lián)篩檢，有沉淀線或出現(xiàn)

6、任一條帶者進(jìn)一步做經(jīng)典梅花孔法定性實(shí)驗(yàn)，所用抗原為人脾浸出液。雙盲比較蛋白微陣列法和ID法檢測(cè)1580份血清及300份獻(xiàn)血員血清，對(duì)比結(jié)果。3、ELISA：所用試劑盒為購于歐盟，測(cè)定方法按說明書進(jìn)行。三種方法檢測(cè)診斷明確的445份血清，比較結(jié)果。 結(jié)果： 1．蛋白微陣列盲法檢測(cè)10份抗ENA抗體標(biāo)準(zhǔn)血清結(jié)果解盲后與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果對(duì)比完全準(zhǔn)確。 2．獻(xiàn)血員的300份血清用蛋白微陣列法和ID法檢測(cè)結(jié)果全部陰性。 3

7、．雙盲比較蛋白微陣列與ID法檢測(cè)1580份連續(xù)送檢血清結(jié)果： 1)以ID為金標(biāo)準(zhǔn)，蛋白微陣列靈敏度抗Sm抗體、抗RNP抗體、抗SSA抗體、抗SSB抗體、抗rRNP抗體95％可信區(qū)間均大于90％，抗Scl-70抗體和抗Jo-1抗體靈敏度95％可信區(qū)間均大于85％；特異度除抗SSA抗體外(84.88％～84.94％)、抗SSB抗體(89.91％～89.95％)、抗rRNP抗體(89.17％～89.41％)其余抗體特異度95％可信區(qū)間

8、均大于909a；除抗SSA抗體(86.87％～86.91％)外其余抗體符合率95％可信區(qū)間均大于90％。p<0.05。 2)抗RNP抗體(κ=0.833)、抗SCL-70抗體(κ=0.786)、抗Jo-1抗體(κ=0.920)三種抗體兩種方法有很好的一致性κ>0.75；在檢測(cè)抗Sm抗體(κ=0.423)、抗SSA抗體(κ=0.646)、抗SSB抗體(κ=0.443)、抗rRNP抗體(κ=0.17)，兩種方法一致性較好。p<0.0

9、5。 3)以ID為金標(biāo)準(zhǔn)，蛋白微陣列檢測(cè)七種抗體的ROc曲線下面積均大于0.9，p<0.05。 4)在抗Sm抗體、抗RNP抗體、抗SSA抗體、抗SSB抗體四種抗體蛋白微陣列陽性率(5.89％、8.40％、29.67％、14.21％)高于ID法(1.65％、6.83％、18.13％、4.95％)，p<0.05。而在檢測(cè)抗Scl-70抗體、抗Jo-1抗體、抗rRNP抗體兩種方法的陽性檢出率沒有差別，p>0.05。 4

10、．三種方法比較結(jié)果： 1)抗Scl-70抗體、抗Jo-1抗體、抗rRNP抗體：蛋白微陣列法與ID法檢測(cè)此三種抗體一致性極好(κ=0.830、0.891、0.769)，p<0.05；蛋白微陣列法檢測(cè)SSC、PM/DM、SLE三組血清三種抗體各自陽性率分別為54.2％、27.3％、16.7％與ID法62.5％、31.8％、11.1％比較無差別，p=0.125、1.000、1.000。蛋白微陣列法與ELISA結(jié)果完全一致。 2

11、)抗Sm抗體：SLE組，免疫微陣列與ID一致性較好κ=0.631，而與ELISA比較一致性極好1(=O．884，p<0．05；抗RNP抗體：在SLE、pSS、CTD各組中三種方法一致性均很好(K>O．7，p<0．05)；抗SSA抗體：蛋白微陣列法與ELISA法一致性極好，各組κ>0.85，p<0.05，蛋白微陣列與ID一致性較好κ在0.4～0.75之間，p<0.05；抗SSB抗體：蛋白微陣列法與ELISA法一致性較好，κ在0.682～0

12、.820之間，p<0.05，蛋白微陣列與ID一致性較差，κ在0.250～0.318之間。 3)抗Sm抗體、抗SSA抗體、抗SSB抗體在各組中陽性檢出率在蛋白微陣列與ELISA之間無差異(p>0.05)，但兩種方法陽性率均大于ID法p<0.05?？筊NP抗體的陽性率比較在各組中蛋白微陣列與ELISA之問無差異，除SLE組蛋白微陣列陽性率大于ID外(p<0.05)，其余各組陽性率與ID法也無差異。 結(jié)論： 1．蛋白微

13、陣列方法檢測(cè)抗ENA抗體靈敏度和特異度均較高，且與ID和ELISA法有較高的符合率，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。 2．檢測(cè)抗Sm抗體、抗RNP抗體、抗SSA抗體、抗SSB抗體敏感度高于ID法，但與ELISA比較無差異。檢測(cè)抗Scl-70抗體、抗Jo-1抗體、抗rRNP抗體的敏感度與ID、ELISA均無差別。 3．蛋白微陣列方法具有高通量、并行、快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)適于臨床篩檢應(yīng)用。但不同技術(shù)平臺(tái)報(bào)告結(jié)果不盡一致，需要進(jìn)一步優(yōu)化穩(wěn)定技