大鼠凝血因子ⅦEGF1片段生物功能的體外研究.pdf

1、第一部分、脂多糖誘導(dǎo)大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)組織因子的體外研究。 目的：選擇最佳濃度的脂多糖（LPS）誘導(dǎo)大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(RAECs)表達(dá)組織因子（TF），并觀察TF 表達(dá)變化，找出TF表達(dá)最強的作用時間,從而建立高度表達(dá)TF的RAECs受損模型。 方法：將0.1μg/mL，1μg/mL，10μg/mL和100μg/mL LPS分別作用RAECs6,12，24,48小時，應(yīng)用MTT比色法檢測細(xì)胞活力，選擇最佳濃度LPS

2、作用RAECs 不同時間，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測RAECs內(nèi)TFmRNA水平，并應(yīng)用免疫組織化學(xué)法和Western blotting法檢測RAECs內(nèi)TF蛋白水平。 結(jié)果：24 小時內(nèi)，濃度為0.1μg/mL和1μg/mL LPS對細(xì)胞活力影響與陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。1μg/mL LPS能顯著上調(diào)RAECsTFmRNA 水平和蛋白水平，2h左右TFmRNA表達(dá)最強，4h左右TF蛋

3、白表達(dá)最強,以后表達(dá)逐漸下降至正常水平。 結(jié)論：24小時內(nèi)，0.1μg/mL和1μg/mL LPS對RAECs細(xì)胞活力無明顯影響，1μg/mLLPS作用RAECs2h左右TFmRNA表達(dá)最強，4h左右TF蛋白表達(dá)最強。 第二部分、大鼠凝血因子EGF1 Ⅶ片段生物功能的體外研究。 目的：探討大鼠凝血因子Ⅶ（rFⅦ）EGF1片段與脂多糖(LPS)誘導(dǎo)后高度表達(dá)TF的大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(RAECs)的結(jié)合能力及其凝血活

4、性。方法：將1μg/mL LPS作用RAECs4h,通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L的rF EGF1 Ⅶ多肽與LPS誘導(dǎo)后的RAECs的結(jié)合能力，流式細(xì)胞儀檢測10μg/mL小鼠凝血因子Ⅶ（mFⅦ）與8μmol/L rF E Ⅶ GF1多肽競爭性結(jié)合TF的能力。應(yīng)用全自動凝血儀檢測rF EGF1 Ⅶ多肽的凝血活性。 結(jié)果：與陰性對照組相比，4μmol/L、8μmol/L、16μmol

5、/L rF EGF1 Ⅶ多肽結(jié)合LPS誘導(dǎo)后的RAECs顯著增多（P<0.05），而且10μg/mLmFⅦ能顯著減少8μmol/LrF EGF1 Ⅶ多肽結(jié)合到高度表達(dá)TF的RAECs 上。rF EGF1 Ⅶ多肽與正常SD大鼠血清組比較，凝血酶原時間明顯延長（P<0.01），而與生理鹽水組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（（P>0.05）。 結(jié)論：rF EGF1 Ⅶ片段能結(jié)合LPS誘導(dǎo)后的高度表達(dá)TF的RAECs，而且它沒有凝血活性。

6、 第三部分、比較三種分離大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞方法的研究。 目的：建立一種有效的、重復(fù)性好的分離RAECs的方法。 方法：采用酶消化法、瞬間熱處理植環(huán)法和植塊法分離RAECs，并進(jìn)行培養(yǎng)、純化和傳代,觀察細(xì)胞生長和形態(tài)，用免疫組織化學(xué)法檢驗VonVillebrand Factor/ Ⅷ因子相關(guān)抗原進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞鑒定。 結(jié)果：采用植塊法分離RAECs，3－5天后可見細(xì)胞貼壁生長，14天呈單層鋪路石樣分布，免疫組織化學(xué)法