食管癌細(xì)胞與神經(jīng)相互作用的形態(tài)學(xué)研究以及神經(jīng)周浸潤(rùn)在食管癌中的意義.pdf

1、【背景】
　　腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞所處的內(nèi)外環(huán)境有密切的關(guān)系。1971年Folkman等首次提出腫瘤能夠促進(jìn)血管生成,并且生成的血管提供腫瘤生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),從此一系列研究揭示了腫瘤與血管的關(guān)系,想通過(guò)抑制腫瘤血管生成來(lái)治療腫瘤。淋巴管轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要方式之一,許多腫瘤自身可以分泌一些分子例如VEGF-C或者VEGF-D等,促進(jìn)腫瘤中淋巴管再生。神經(jīng)常與血管、淋巴管在體內(nèi)相伴行,類似于血管生成和淋巴管新生一些研究顯示腫瘤

2、中可能也有神經(jīng)新生;精神心理因素與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),患抑郁癥、應(yīng)激等癥的患者腫瘤患病率比普通人群高。研究證實(shí),多種惡性腫瘤組織中有神經(jīng)纖維的分布,但是腫瘤與神經(jīng)纖維之間相互作用關(guān)系目前尚不清楚。
　　【目的】
　　1.建立腫瘤與神經(jīng)三維共培養(yǎng)模型,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供平臺(tái)。
　　2.體外研究腫瘤與神經(jīng)相互作用的形態(tài)學(xué)表現(xiàn),為揭示腫瘤與神經(jīng)的相互影響提供依據(jù)。
　　3.比較食管癌神經(jīng)周浸潤(rùn)的兩種檢測(cè)方法,為臨床統(tǒng)一

3、診斷方法提供支持;分析食管鱗癌的神經(jīng)周浸潤(rùn)與患者臨床病理關(guān)系。
　　【方法】
　　1.采用原代分離培養(yǎng)的方法,提取大鼠的背根神經(jīng)節(jié);用慢病毒轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白于食管癌細(xì)胞系EC109,Matrigel包被背根節(jié)和食管癌EC109細(xì)胞進(jìn)行三維共培養(yǎng)。
　　2.利用腫瘤細(xì)胞與神經(jīng)混合培養(yǎng)法和三維共培養(yǎng)法,觀察食管癌細(xì)胞與神經(jīng)生長(zhǎng)之間的相互作用,計(jì)算神經(jīng)軸突生長(zhǎng)的數(shù)目與面積,觀察神經(jīng)節(jié)對(duì)腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響以及腫瘤細(xì)胞沿神經(jīng)遷

4、移的神經(jīng)周浸潤(rùn)現(xiàn)象。采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)食管癌細(xì)胞系EC109和EC9706中神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)的表達(dá)。
　　3.分別運(yùn)用HE染色和神經(jīng)元特異性抗體S100免疫組織化學(xué)法,共同評(píng)價(jià)126例食管鱗癌標(biāo)本中神經(jīng)周浸潤(rùn)的水平,分析兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn);分析神經(jīng)周食管癌細(xì)胞浸潤(rùn)與患者的臨床病理關(guān)系。
　　【結(jié)果】
　　1.成功地建立了食管癌細(xì)胞系與大鼠的背根神經(jīng)節(jié)體外三維共培養(yǎng)模型,為進(jìn)一步實(shí)

5、驗(yàn)提供了良好的研究平臺(tái)。
　　2.食管癌細(xì)胞與背根節(jié)細(xì)胞混合普通培養(yǎng),背根節(jié)發(fā)出的軸突靶向腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。食管癌細(xì)胞與背根節(jié)組織三維共培養(yǎng),面向腫瘤細(xì)胞側(cè)背根節(jié)組織長(zhǎng)出的軸突較長(zhǎng)、較濃密,背對(duì)腫瘤細(xì)胞側(cè)的軸突則較短、較稀疏;共培養(yǎng)第4天,面向腫瘤側(cè)與背對(duì)側(cè)神經(jīng)纖維的數(shù)目分別為28和7個(gè),面向腫瘤側(cè)與背對(duì)側(cè)神經(jīng)纖維面積分別為109μm2和42μm2;共培養(yǎng)第7天,面向腫瘤側(cè)神經(jīng)軸突的數(shù)目與面積分別為87個(gè)和346μm2,背對(duì)側(cè)分別為2

6、3個(gè)和141μm2,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),NGF和BDNF表達(dá)于食管癌細(xì)胞。另外三維共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),面向神經(jīng)側(cè)的腫瘤細(xì)胞形成突起樣結(jié)構(gòu)向神經(jīng)節(jié)方向遷移,而背側(cè)并沒(méi)有出現(xiàn)此現(xiàn)象;第7天時(shí),可見腫瘤細(xì)胞增殖明顯,并向著DRG方向凸起性的生長(zhǎng);第9天時(shí),神經(jīng)軸突與腫瘤細(xì)胞接觸后,腫瘤細(xì)胞沿著軸突進(jìn)行遷移;第11天時(shí),沿著神經(jīng)纖維遷移的腫瘤細(xì)胞數(shù)量明顯增多,腫瘤細(xì)胞集落邊緣更加不規(guī)則。
　　3.S100組化染色法

7、與HE染色法相比,S100染色法能夠清晰顯示HE染色法很難確定的神經(jīng)周浸潤(rùn)。HE染色判斷126例食管癌患者神經(jīng)周浸潤(rùn)的發(fā)生率為28.57％,而S100染色判斷同一研究對(duì)象神經(jīng)周浸潤(rùn)的發(fā)生率為51.59%。配對(duì)樣本卡方檢驗(yàn)P<0.01、一致性度量Kapaa=0.483,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,兩種檢測(cè)方法效果差別顯著。食管癌的神經(jīng)周浸潤(rùn)與患者的腫瘤大小(P=0.001)、AJCC分期(P<0.001)、T分期(P<0.01)以及腫瘤血管侵犯(P=0

8、.07)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與年齡、性別、組織分化程度、腫瘤位置、疼痛等未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　【結(jié)論】
　　食管癌與神經(jīng)之間具有相互促進(jìn)作用。食管癌細(xì)胞可以導(dǎo)向神經(jīng)軸突向其生長(zhǎng),并且食管癌對(duì)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用;神經(jīng)可以對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖等生物學(xué)行為產(chǎn)生影響,并且食管癌細(xì)胞可以沿著神經(jīng)纖維逆行向神經(jīng)元方向遷移,即神經(jīng)周浸潤(rùn)。S100免疫組化染色法比HE染色法對(duì)神經(jīng)周浸潤(rùn)的判斷更加準(zhǔn)確,食管癌的神經(jīng)周浸潤(rùn)可能在食管癌的發(fā)生