食管癌組織中MT和溶菌酶C相互作用的研究.pdf

1、目的:食管癌是人類常見的惡性腫瘤之一,對人類的健康已經(jīng)構成嚴重的威脅。我國是食管癌的高發(fā)區(qū),其發(fā)病率和死亡率均居世界之首。但是食管癌缺乏有效的診斷和治療手段,患者預后多較差。想要有效的改善食管癌患者的預后就要解決早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的問題。因此早期診斷食管癌,是目前關于食管癌研究的熱門問題,只要解決食管癌早期診斷問題,提高食管癌的治療效果、提高術后病人的5年生存率等問題將迎刃而解。蛋白質組學作為腫瘤研究的新平臺,通過從整體水平研究食管

2、癌蛋白質間的網(wǎng)絡調控,對食管癌早期診斷,尋找新標志物,治療以及開發(fā)藥物治療新靶點等方面具有重要意義。
　　 金屬硫蛋白(Metallothionein,MT)是在1957年由馬腎中首次分離得到的。是一種分子量低(6-7kDa)、富含半胱氨酸(30％)、缺乏芳香族氨基酸的蛋白質,具有維持金屬離子內穩(wěn)態(tài)、重金屬解毒和清除自由基等方面的作用。是目前為人們所知的最有效的自由基清除劑,可以起到抑制癌癥發(fā)生、消除炎癥、防治腎病和治療胃潰瘍等

3、作用。其特殊的結構和理化特性以及獨特的生物學功能對于疾病的發(fā)生、發(fā)展的研究和探討中起到了重要作用。目前關于MT在食管癌組織與癌旁正常組織之間蛋白質組學研究報道較多,而針對MT相關蛋白質的研究較少,尋找及篩選食管癌組織和癌旁正常組織之間MT相關的特異性差異蛋白質對解決食管癌早期診斷問題具有重要意義。本研究擬應用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)和SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-Polyacrylam

4、idegelelectrophoresis,SDS-PAGE)技術結合液相質譜聯(lián)用(Liquidchromatography-massspectrometry,LC-MS)技術,對食管癌組織與癌旁正常組織之間MT相關的特異性差異蛋白質進行篩選及鑒定,以找到同食管癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關的蛋白,從而通過對這些相關蛋白的進一步深入的研究來推動食管癌早期診斷、治療等問題的解決。
　　 方法:
　　 1.選取2011年9月至201

5、2年2月在河北醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院胸外科行手術治療的食管癌患者16例,其中男10例,女6例,年齡42-76歲,平均年齡(57.8±12.7)歲,其中食管上段癌2例,中段癌8例,下段癌6例。國際食管癌TNM分期:Ⅰ期2例,ⅡA期5例,ⅡB期4例,Ⅲ期4例,Ⅳ期1例。組織分級:高分化癌5例,中分化癌8例,低分化癌3例。術中取腫瘤中心(去除壞死組織)及選取距癌緣5cm以上的食管“正?！闭衬そM織作為正常對照,用液氮罐轉入-80℃冰箱凍存。待術后

6、病理證實為食管鱗狀細胞癌并確認食管殘端為正常食管粘膜上皮后入組研究。
　　 2.提取食管鱗癌組織及癌旁正常組織中的可溶蛋白質,以Bradford方法檢測樣品中蛋白質的濃度。應用Co-IP技術提取MT及其相關蛋白,應用SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳技術將樣品中的蛋白進行分離,比較食管癌組織和癌旁正常組織的凝膠電泳圖譜,取MT條帶明顯處切取條帶。
　　 3.將差異明顯的蛋白條帶篩選出來,在膠內進行溶解并將這些蛋白質提取出來,將提

7、取的蛋白用LC-MS技術分析鑒定,并通過生物信息數(shù)據(jù)庫分析所鑒定出差異蛋白的功能。
　　 4.應用蛋白質印跡的方法(Westernblot)驗證其中一種差異蛋白水平的表達,與蛋白質組學的結果進行對照。
　　
　　 5.統(tǒng)計學分析:利用FujifilmLas-4000軟件統(tǒng)計分析目標條帶的積分光密度,以β-actin作為內參。應用SPSS13.0統(tǒng)計學處理軟件行單因素方差分析,各項檢測結果以均數(shù)±標準差((X)±

8、SD)記錄,并用EXCEL作圖。
　　 結果:
　　 1.采用Co-IP聯(lián)合SDS-PAGE技術,獲得了食管癌組織及癌旁正常組織MT相關蛋白的蛋白圖譜。分析得到的蛋白圖譜并從中選取64條差異明顯的蛋白條帶,切取這些蛋白質條帶,將蛋白質條帶在膠內進行溶解,用液相色譜質譜聯(lián)用LC-MS技術對所得的蛋白質混合物進行分析,鑒定出31種蛋白質,將結構蛋白及高豐度蛋白從中篩除,通過生物信息數(shù)據(jù)軟件對其余蛋白進行分析,確定出3種可能與

9、食管癌發(fā)生、發(fā)展有關的蛋白質,分別為溶菌酶C(lysozymeC)、鋅α2糖蛋白(alpha-2-glycoprotein1,zinc)、載脂蛋白-1亞型1(lipocalin-1isoform1)。
　　 2.應用Westernblot技術對lysozymeC在蛋白質水平的表達進行驗證,結果顯示:與癌旁正常組織相比,lysozymeC于MT的蛋白復合物的表達上調(t=-32.183,p=0.000),與蛋白質組學得到的結果一致

10、。
　　 結論:
　　 1.通過實驗發(fā)現(xiàn)3種食管癌組織及癌旁正常組織之間的MT相關的差異蛋白,并證實食管癌組織及癌旁正常組織中MT相關蛋白質表達存在差異。這3種差異表達的相關蛋白可能參與了食管癌的發(fā)生、侵襲及轉移等過程。
　　 2.對其中一種差異蛋白lysozymeC應用Westernblot的方法在蛋白水平的表達進行了驗證,其結果與蛋白質組學方法結果一致,證明本研究結果具有較高可信度。
　　 3.lys