碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)體NCBT剪切異構(gòu)體的克隆、鑒定與表達(dá)分析.pdf

1、酸堿平衡或pH影響許多重要的生理學(xué)過(guò)程，比如影響中樞系統(tǒng)的興奮性以及哺乳動(dòng)物的生殖過(guò)程等等。因此保持機(jī)體及細(xì)胞的酸堿穩(wěn)態(tài)具有重要的生理學(xué)意義。細(xì)胞具有一系列復(fù)雜的分子機(jī)制來(lái)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的酸堿平衡。
　　 SLC4家族（solute carrier 4 family）的鈉離子偶聯(lián)碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NCBT(Na-coupled HCO3-transporter)在細(xì)胞pH調(diào)控以及HCO3–的跨上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)中具有重要作用。這些NC

2、BT包括五個(gè)不同基因的產(chǎn)物，根據(jù)離子轉(zhuǎn)運(yùn)模式的不同，可以將這些NCBT分為兩類(lèi)：（1）生電性的NBCe1(SLC4A4)、NBCe2(SLC4A5)；（2）電中性的NBCn1(SLC4A7)、NBCn2(SLC4A10)、NDCBE(SLC4A8)。
　　 由于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的不同或mNRA選擇性剪切單元的存在，每種NCBT基因均可產(chǎn)生多種不同的剪切體。譬如編碼生電性NBCe1的SLC4A4基因含有兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，此外，羧基端

3、含有一個(gè)選擇性剪切單元。理論上SLC4A4可以產(chǎn)生四種不同的NBCe1剪切體。前人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)三種NBCe1剪切體：NBCe1-A，NBCe1-B和NBCe1-C。NBCe1-A具有較短的獨(dú)特的氨基末端（Nt），而NBCe1-B和C具有共同的較長(zhǎng)的Nt。第二個(gè)例子是編碼電中性NBCn2的SLC4A10基因，該基因目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)不同的選擇性剪切單元。理論上SLC4A10基因也可以產(chǎn)生四種剪切體：NBCn2-A/B/C/D，前人的研究已經(jīng)克

4、隆了NBCn2-A/B/C的cDNA，但是NBCn2-D的cDNA還未見(jiàn)成功克隆。
　　 本研究中，我們以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)Slc4a4和Slc4a10選擇性剪切異構(gòu)體的表達(dá)進(jìn)行了研究。我們通過(guò)RT-PCR技術(shù)，在mRNA水平上系統(tǒng)研究了NBCe1不同剪切體在小鼠的生殖道組織中的表達(dá)及分布。在小鼠生殖道組織中，我們成功地克隆并鑒定出了五種NBCe1的剪切異構(gòu)體：NBCe1-A/B/C/D/E，其中NBCe1-D和NBCe1-E是

5、我們首次克隆的新型剪切異構(gòu)體。與NBCe1-A/B/C比較，NBCe1-D/E缺失了一段27堿基的序列，即cassette I。Cassette I是我們新發(fā)現(xiàn)的Slc4a4基因的一個(gè)選擇性剪切單元，它的缺失由于Slc4a4的第六外顯子的選擇性剪切方式所致。
　　 NBCn2主要表達(dá)在中樞系統(tǒng)中。在本研究中，我們通過(guò)cDNA克隆，從小鼠延腦（MD）和大腦皮下層（SCX）組織中均成功的克隆了NBCn2-D。通過(guò)菌落PCR技術(shù)，我們