一個組成型表達的草魚ADAR1基因剪切異構(gòu)體ADAR1a的鑒定與特征.pdf

1、作為ADAR家族中的一員，ADAR1(adenosine deaminase acting on RNA)能夠?qū)㈦p鏈RNA的腺嘌呤(A)置換為次黃嘌呤(I)。在哺乳動物中，ADAR1擁有很多剪切異構(gòu)體，包括研究較為普遍的能被干擾素誘導(dǎo)表達的150kD大小的剪切異構(gòu)體ADAR1-p150和組成型表達的110kD大小的剪切異構(gòu)體ADAR1-p110。ADAR1這種結(jié)構(gòu)的多樣性可能反應(yīng)了其不同剪切異構(gòu)體之間功能的多樣及差異。ADAR1不同剪切

2、異構(gòu)體也被發(fā)現(xiàn)存在于魚類之中。在我們之前的研究中，我們已經(jīng)在草魚中克隆得到了 ADAR1兩種不同剪切異構(gòu)體CiADAR1和CiADAR1-like，它們都可以被干擾素誘導(dǎo)表達。在本文中，我們鑒定了一個新的草魚ADAR1基因剪切異構(gòu)體ADAR1a。ADAR1a基因包含15個外顯子和14個內(nèi)含子，它的全長cDNA序列包括359bp的5'UTR，229bp的3'UTR和一個2592bp的最大ORF，編碼983個氨基酸的多肽。ADAR1a蛋白具

3、有1個Z-DNA結(jié)合域，3個dsRNA結(jié)合域和一個高度保守的水解脫氨酶激酶活性區(qū)。在草魚CIK細胞中，通過western blot分析，草魚ADAR1a蛋白表現(xiàn)出組成型表達特性并不受poly(I:C)刺激影響。在正常狀況下，草魚腎細胞中ADAR1a蛋白主要分布在細胞核，而通過poly(I:C)刺激，隨著時間推移，ADAR1a蛋白由細胞核轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)，其具體分子機制尚不清楚。
　　為了進一步研究草魚ADAR1a基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，通

4、過5'full Race技術(shù)，我們確定了草魚ADAR1a的轉(zhuǎn)錄起始位點，位于ADAR1基因的第二個外顯子上。然后我們克隆了其包含部分5'UTR及其上游序列在內(nèi)共1303bp作為ADAR1a基因的啟動子，通過軟件分析，其中包含4個干擾素調(diào)節(jié)因子元件。通過構(gòu)建草魚IRF1、IRF3的真核表達載體pcDNA3.1-IRF1和pcDNA3.1-IRF3與pGL3-CiADAR1a啟動子報告載體共轉(zhuǎn)入草魚腎細胞。雙熒光素酶活性分析結(jié)果顯示在草魚腎

5、細胞中無論是草魚IRF1、IRF3蛋白還是Poly I:C都不能影響草魚ADAR1a蛋白的表達。
　　通過其分子與表達機制，細胞內(nèi)亞定位結(jié)果及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，我們推測草魚ADAR1a與哺乳動物ADAR1蛋白剪切異構(gòu)體ADAR1-p110具有高度同源性。隨后，通過序列比對推測其核輸出信號(NES)序列，并構(gòu)建pEGFP-C1-ADAR1a，pEGFP-C1-ADAR1N，pEGFP-C1-ADAR1NΔNES表達載體，瞬時轉(zhuǎn)染進CI