肝膽排泄轉(zhuǎn)運(yùn)體講訴

1、藥物排泄的研究進(jìn)展,講演人：王婷婷,2014年4月,目 錄,（一）藥物排泄途徑,,（二）轉(zhuǎn)運(yùn)體的分類,,（三）肝臟藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體,,,（三）肝臟藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體,一、體內(nèi)試驗(yàn) 基因缺陷動(dòng)物模型,,先天遺傳性基因缺陷模型,基因敲除模型,二、體內(nèi)/體外試驗(yàn) 肝臟灌流技術(shù),,離體肝臟灌流,在體肝臟灌流,（四）研究肝臟藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的常用方法,,三、體外試驗(yàn),,非洲爪蟾卵母細(xì)胞：cRNA注射,單轉(zhuǎn)染細(xì)

2、胞：HEK293,雙轉(zhuǎn)染細(xì)胞：Hela、MDCK-П、LLC-PK1,CMVs（微管膜囊泡）實(shí)驗(yàn),四、RT-PCR技術(shù)——半定量測(cè)蛋白表達(dá) Western Blot技術(shù)——定量測(cè)蛋白表達(dá),（四）研究肝臟藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的常用方法,,（五）文獻(xiàn)研究,頭孢妥侖（CDRT）膽汁排泄的分子機(jī)制及其對(duì)肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)作用的研究,,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?頭孢妥侖,轉(zhuǎn)運(yùn)體(Mrp2、Bcrp或P-gp),？轉(zhuǎn)運(yùn),,頭孢妥侖,？影響,(Mrp

3、2、Bcrp或P-gp)蛋白表達(dá),二、實(shí)驗(yàn)思路,三、實(shí)驗(yàn)材料,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,Wistar大鼠，雄性，體重230~250g,主要試劑,頭孢妥侖標(biāo)準(zhǔn)品等,主要儀器,肝灌流儀，HPLC等,肝臟的血液供應(yīng)非常豐富，接受兩種來(lái)源的血供。（1）門靜脈。主要接受來(lái)自胃腸和脾臟的血液；（2）腹腔動(dòng)脈的分支肝動(dòng)脈。門靜脈與肝動(dòng)脈進(jìn)入肝臟后，反復(fù)分支，在肝小葉周圍形成小葉間動(dòng)脈和小葉間靜脈進(jìn)入肝血竇中，再經(jīng)中央靜脈注入肝靜脈。,四、實(shí)驗(yàn)方法,1.肝灌流

4、實(shí)驗(yàn),肝灌流裝置=灌流系統(tǒng)+ 恒溫系統(tǒng)+氣體交換系統(tǒng),1.1.實(shí)驗(yàn)相關(guān)溶液的配制 (1)抗凝緩沖液的配制 枸櫞酸三鈉 15.6g 枸椽酸 5.7g ddH2O 600m1,(2)磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制 NaCl(58.44)

5、 8.0g KCl(74.55) 0.2g Na2HPO4.12H2O(358.14) 2.9g KH2PO4(136.09) 加dd H2O

6、 1000ml 調(diào)pH 7.4 with HCl,(3)灌流緩沖液的配制NaCl(58.44) 118mM 6.9gKCl(74.55) 4.7 mM 0.35gMgSO4.7H2O(246.27)

7、1.2 mM 0.30gKH2PO4(136.09) 1.2 mM 0.16gNaHCO3(84.01) 25 mM 2.10gGlu(198.17) 5 mM 0.96gCaCl2(110.99)

8、 2.5 mM 0.28g加ddH2O 1000m1調(diào)pH 7.4 with NaOH,1.2灌流所需的牛血紅細(xì)胞制備 (1) 3 L新鮮牛血與600m1抗凝緩沖液混勻，過(guò)濾，三層紗布置于大漏斗中。使牛血貼壁流下，以免紅細(xì)胞因機(jī)械外力被破碎; (2)離心

9、,5000rpm, l0min, 4 ℃ ，將上層的血漿、血小板和白細(xì)胞棄去，下層為牛血紅細(xì)胞; (3)加入等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS),混勻，離心，3000rpm, l0min,4 ℃ ，清洗紅細(xì)胞，棄上清; (4)重復(fù)步驟(3)3次，收集下層干凈的牛血紅細(xì)胞，4℃保存，備灌流時(shí)使用。,1.3.原位肝灌流法 (1)灌流室預(yù)熱，使溫度達(dá)37℃;將牛血紅細(xì)胞與灌流緩沖液混勻，使紅細(xì)胞的終濃度為20%，作為灌流

10、液。設(shè)立對(duì)照組(頭孢妥侖(1 uM)和實(shí)驗(yàn)組(頭孢妥侖(1 uM)和不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特異性抑制劑(20 uM))，具體研究如下。把灌流緩沖液和含藥的灌流液放入水浴鍋中加熱至37 ℃ ，同時(shí)供氧;,(2) Wistar雄性大鼠于實(shí)驗(yàn)前夜禁食(不禁水)，烏拉坦麻醉，腹部U型開(kāi)口，將內(nèi)臟移至右側(cè)，剝離并充分暴露門靜脈、下腔靜脈、右腎動(dòng)靜脈和膽管; (3)膽管插管，固定，此時(shí)可見(jiàn)膽汁緩慢流出; (4)門靜脈插管，固定，用預(yù)熱的灌

11、流緩沖液灌流肝臟，流速為12m1/min; (5)迅速剪斷下腔靜脈腹腔段，沖去肝臟內(nèi)原有的血液，結(jié)扎右腎動(dòng)靜脈;,(6)迅速打開(kāi)胸腔，右心耳插管，使液體緩慢流出; (7)肝臟平衡l0min后，實(shí)驗(yàn)組用含抑制劑((20 uM)的灌流液灌流5min，再換含頭孢妥侖(1 uM)和抑制劑((20 uM)的灌流液灌流;對(duì)照組用含等體積的抑制劑溶劑的灌流液灌流5min，再換含頭孢妥侖((1uM)和等體積的抑制劑溶劑的灌流液灌流肝臟;

12、 (8)于0.5、1、3、 10、15、20、25、30min收集出口灌流液; (9)于5, 15, 25min收集膽汁樣品; (10)高效液相色譜法測(cè)定頭孢妥侖含量，考察肝攝取率和膽汁累積排泄率的差別。,肝臟攝取率 EH=1-Cin/Cout 膽汁中藥物濃度×膽汁體積　　　　　　　　　　　　

13、 灌流液中藥物濃度×灌流速度×灌流時(shí)間,膽汁累積排泄率=,1.4.高效液相色譜法測(cè)定樣品中頭孢妥侖的含量(1)色譜條件 色譜柱:Capcell pak C18 UG120 4.6X250mm(日本資生堂); 流動(dòng)相:0.1%醋酸銨:甲醇(65: 35); 流速:0.8 ml/min; 檢測(cè)波長(zhǎng):295nm; 進(jìn)樣器溫度:4℃; 進(jìn)樣體積:25 ul,(2)

14、出口灌流液樣品預(yù)處理 離心，3000 rpm, 5 min, 4 ℃ ，取上清液90 ul置新的Ep管，加內(nèi)標(biāo)(25 ug/ml)10 ul,混勻，再加入甲醇200 u1,混勻，離心12000 rpm,15 min,4 ℃。取上清液100 u1進(jìn)樣; (3)膽汁樣品預(yù)處理 取膽汁樣品10 ul，加30 u1 ddHzO，內(nèi)標(biāo)l0 ul,混勻，加50 u1甲醇，混勻，離心，12000rpm, 15 min, 4 ℃

15、 。取上清液70 u1進(jìn)樣。,2.頭孢妥侖對(duì)肝臟Mrp2,Bcrp,P-gp,Oct1和Oat2 mRNA表達(dá)的影響——RT-PCR3.證實(shí)頭孢妥侖對(duì)肝臟Mrp2蛋白表達(dá)情況——Western Blot,五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果,1.肝灌流實(shí)驗(yàn)1.1肝攝取率 加入抑制劑不影響CDRT的肝攝取,1.2膽汁累積排泄率 Mrp2和Bcrp參與CDRT膽汁排泄

16、 P-gp不參與,2.RT-PCR Mrp2、Bcrp和Oat2的mRNA上調(diào) P-gp和Oct1的mRNA下調(diào),3. Western Blot CDRT對(duì)Mrp2蛋白表達(dá)的影響有劑量依賴性,謝 謝 大 家！,2014年4月,人有了知識(shí)，就會(huì)具備各種分析能力，明辨是非的能力。