大鼠胚胎期及出生早期乳腺發(fā)育和乳腺干細胞的研究.pdf

1、哺乳動物的乳腺是一個很特殊的器官，雌性動物的乳腺可以在重復的懷孕和生產(chǎn)的多次循環(huán)中再生、退化，是動物出生后唯一可以多次重復再生的器官。早在1959年，DeOme等人研究證實，乳腺組織塊移植到去除乳腺腺上皮的小鼠乳腺脂肪墊中可以再生小鼠乳腺。1967年Horishino等人進行的系列移植研究表明，乳腺上皮細胞具有自我復制的能力，且可以維持到第七次移植。1998年Kordon等人通過對嚙齒類動物乳腺的研究，發(fā)現(xiàn)乳腺中存在至少一種以上多能干/

2、祖細胞。由于再生乳腺與乳腺腫瘤的關系以及乳腺自身發(fā)育的特殊性，乳腺是研究器官發(fā)生、細胞分化、器官修復再生等機理的合適的模型。1999年，Chepko和Smith證實了乳腺中存在一個類乳腺干細胞祖系(lineage)，正是這些乳腺干細胞保證了哺乳動物乳腺在多次的懷孕生產(chǎn)過程中乳腺再生、泌乳和退化的周期的維持。不同發(fā)育時期的動物乳腺中都存在一定比例的干細胞，正是這些干細胞維持和保證了乳腺發(fā)育的特征。 因此，研究大鼠胚胎期和出生早期乳

3、腺的各個發(fā)育階段的形態(tài)學特點、各種細胞成分的組成和分布規(guī)律，以及乳腺干細胞在各個時期的特點將幫助我們更深入地了解乳腺的發(fā)生、發(fā)育以及乳腺干細胞的生物學特性，并有助于了解乳腺干細胞與乳腺發(fā)育、再生、癌變之間的關系。 我們以大鼠為模型，運用組織學、免疫組織化學的手段，研究了大鼠胚胎期和出生早期的乳腺發(fā)育規(guī)律，以及周圍組織的發(fā)生演變；大鼠乳腺組織發(fā)育過程中乳腺干細胞的分布、形態(tài)和標記。 一、胚胎期及出生早期的大鼠乳腺發(fā)育的形態(tài)

4、學 選取妊娠第14天、17天、20天胚胎及出生后3天、8天、16天的幼鼠，采用Bouin固定液固定，梯度乙醇脫水，胚胎期使用甲苯透明，出生后使用二甲苯透明，石蠟包埋，5μm厚度連續(xù)切片。采用HE染色的方法研究大鼠胚胎期和出生早期乳腺的形態(tài)學變化。 形態(tài)學觀察結果顯示： 14日齡鼠胚在胸壁兩側(cè)出現(xiàn)兩個高起的乳腺嵴，由外胚層局部增厚所成。外胚層的乳腺嵴向深部延伸，形成上皮細胞團，即乳腺原基—乳腺芽。周圍的間充質(zhì)細胞環(huán)

5、繞乳腺芽成同心圓排列形成厚厚一層乳腺間充質(zhì)。 17日齡的鼠胚，乳腺芽的上皮細胞增殖形成一個細胞索，伸入其下方的間充質(zhì)，往下延伸形成初級導管，管壁的上皮細胞中出現(xiàn)有絲分裂。導管末端的管腔內(nèi)有實心的細胞團。初級導管管壁上皮內(nèi)可見少量的小亮細胞，其體積較小，呈圓形，細胞質(zhì)染色比較淺亮。周圍的結締組織中可以看到未分化的間充質(zhì)細胞和微血管、幼稚的成纖維細胞、成熟的成纖維細胞和一些嗜堿性顆粒細胞。 20日齡的鼠胚，初級導管形成中空的

6、次級導管，導管出現(xiàn)分支，分布在乳脂墊前體內(nèi)。次級導管上皮細胞內(nèi)可見有絲分裂，零星分布著一些小亮細胞和大亮細胞。管壁的外周包圍著一薄層的結締組織。乳脂墊前體形成，次級導管及其分支進入乳脂墊前體。乳脂墊前體主要由前脂肪細胞組成，其間還可見橢圓形的嗜酸性細胞、梭形的成纖維細胞，以及微血管。 出生后3天的幼鼠，腺體增大，次級導管上皮細胞增多，形成雙層。導管末端細胞多層，緊密排列，可見很少量的體積較小的小亮細胞。導管周圍的脂肪組織逐漸成熟

7、，發(fā)育成為乳脂墊。脂肪組織內(nèi)主要由脂肪細胞組成，還可見成纖維細胞，小血管斷面，嗜酸性細胞。 出生后8天的幼鼠，乳脂墊內(nèi)可見次級導管的斷面。導管上皮細胞中可見不同時期的有絲分裂，細胞分裂比較旺盛。可見少量的體積較小的小亮細胞。 導管周圍的脂肪組織進一步成熟，脂肪組織內(nèi)可見成纖維細胞，血管斷面，嗜酸性細胞。 出生后16天的幼鼠，次級導管上皮細胞中間可見少量的體積較小的圓形的小亮細胞。小亮細胞多位于導管基底部。導管周圍

8、的脂肪組織，已經(jīng)發(fā)育成熟，脂肪組織內(nèi)可見成纖維細胞和嗜酸性細胞，血管、神經(jīng)的斷面。 以上結果表明：胚胎期乳腺發(fā)育有三個主要的特征：1)妊娠第14天，外胚層的乳腺嵴向深部延伸，形成乳腺芽；妊娠第17天，形成實心的初級導管；妊娠第20天，初級導管形成中空的次級導管，并出現(xiàn)分支。2)妊娠17天發(fā)現(xiàn)初級導管上皮中有小亮細胞出現(xiàn)；妊娠20天在次級導管上皮中出現(xiàn)小亮細胞和大亮細胞。3)妊娠第14天，乳腺間充質(zhì)包裹在乳腺芽周圍；妊娠第17天，

9、乳腺間充質(zhì)已分化為結締組織；妊娠第20天，乳脂墊前體形成。出生后早期次級導管發(fā)育緩慢，無明顯變化；出生后3天，乳脂墊前體發(fā)育為乳脂墊。 二、免疫組織化學方法鑒定乳腺干細胞和乳腺上皮細胞 選取妊娠20天胚胎及出生后3天、8天的幼鼠，Bouin固定液固定，石蠟包埋與切片。采用免疫酶組織化學和免疫熒光組織化學方法，以Sca-1和CK18為標記蛋白，分別鑒定乳腺干細胞和乳腺上皮細胞。 免疫酶組織化學觀察結果顯示，妊娠第2

10、0天的鼠胚，在次級導管基底部出現(xiàn)Sca-1陽性細胞，細胞數(shù)目很少，零星分布。在次級導管靠近管腔處出現(xiàn)CK18陽性細胞，細胞數(shù)目也很少。出生后3天和8天的乳鼠，在次級導管基底部的Sca-1陽性細胞呈強陽性染色，細胞數(shù)目很少，零星分布。CK18陽性細胞數(shù)目仍很少，但呈緩慢增長趨勢，主要分布在靠近管腔處。Sca-1陽性細胞為乳腺干細胞；根據(jù)細胞的形態(tài)大小和分布位置，確定Sca-1陽性細胞是小亮細胞。CK18陽性細胞為已分化的腺上皮細胞。