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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景與目的:2013年的最新統(tǒng)計(jì)顯示全世界女性每一年死于乳腺癌的人數(shù)大于癌癥總死亡人數(shù)的15%,乳腺癌成為女性最常見的惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅全球女性的健康。原發(fā)腫瘤病灶包含一般的腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞,腫瘤干細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性,對(duì)手術(shù),放化療不敏感,常規(guī)的治療方法并不能徹底的將其殺死,進(jìn)而腫瘤預(yù)后不佳。乳腺癌干細(xì)胞是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、放化療抵抗的重要原因。以乳腺癌干細(xì)胞尤其是乳腺癌干細(xì)胞相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為靶點(diǎn)的乳腺癌治療更為有效和徹底,為
2、臨床徹底治愈乳腺癌提供了新的方法和思路。
亞洲和歐美國家的飲食結(jié)構(gòu)不同,飲食中的Genistein是導(dǎo)致亞洲,尤其是東南亞地區(qū)居民的乳腺癌發(fā)病率相對(duì)于其他地區(qū)明顯較低的關(guān)鍵。Genistein是大豆類植物中天然存在的異黃酮類物質(zhì),可通過多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用于癌細(xì)胞。而這些信號(hào)傳導(dǎo)通路同時(shí)在乳腺癌干細(xì)胞的信號(hào)調(diào)控中起到重要作用。特別是近期關(guān)于Hedgehog(Hh)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究,提示其異?;罨谌橄侔┑陌l(fā)生發(fā)展中起到重要作
3、用。
本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖翘接慓enistein對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的作用及其機(jī)制,為治療乳腺癌提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù),具有重要的臨床和病理意義。
方法:本研究以乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和裸鼠乳腺癌移植瘤模型作為主要研究對(duì)象。采用CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定24小時(shí)IC50的Genistein的劑量。分別通過集落形成實(shí)驗(yàn)和AV-PI流式細(xì)胞分析驗(yàn)證Genistein對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。其次進(jìn)一步通過成球試驗(yàn)定性分析和流式細(xì)胞技術(shù)
4、檢測(cè)乳腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44+CD24-相對(duì)定量分析,并且用Western Blot進(jìn)一步驗(yàn)證乳腺癌干細(xì)胞另一重要標(biāo)記物ALDH1的表達(dá),探討Genistein對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的作用。
裸鼠乳腺癌模型來驗(yàn)證上述體外試驗(yàn)得到的結(jié)論。通過比較形成腫瘤的大小,免疫組化檢測(cè)乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1的表達(dá),驗(yàn)證Genistein小鼠體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)結(jié)果。
最后蛋白水平應(yīng)用Western Blot,基因水平應(yīng)用real
5、-time PCR檢測(cè)Genistein對(duì)實(shí)驗(yàn)組的Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的特異性蛋白和基因的影響。
結(jié)果:
1.CCK-8法檢測(cè)Genistein對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響結(jié)果提示:低濃度劑量時(shí)Genistein對(duì)其抑制作用很弱;較高濃度時(shí)抑制作用明顯增強(qiáng)。24h其IC50為32.5μg/ml。集落形成試驗(yàn)5μg/ml Genistein的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)為81%,10μg/ml即可觀察到明顯的集落數(shù)目的降低;15μg
6、/ml Genistein作用于乳腺癌細(xì)胞,基本不形成集落。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,在0、15、30μg/ml Genistein三個(gè)實(shí)驗(yàn)組早期凋亡率分別為1.50%、18.38%、29.45%。
2.乳腺球形成試驗(yàn)結(jié)果顯示Genistein實(shí)驗(yàn)組乳腺球的體積明顯低于對(duì)照組,數(shù)目減少。并且實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞有出現(xiàn)凋亡和壞死。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD44+CD24-細(xì)胞的比例:對(duì)照組CD44+CD24細(xì)胞占總細(xì)胞的比例為1.79%。15μg
7、/ml、30μg/mlGenistein實(shí)驗(yàn)組CD44+CD24-細(xì)胞占總細(xì)胞的比例分別為0.93%、0.88%。Western blot檢測(cè)Genistein實(shí)驗(yàn)組ALDH1的表達(dá)低于對(duì)照組。0、5、10μg/ml Genistein的ALDH1蛋白的表達(dá)分別為1.57±0.21、1.02±0.37、0.71±0.43。
3.小鼠腫瘤稱重,自第一次給藥第21天后,0、5、10μg/ml Genistein作用的腫瘤重量分別為
8、2.21±0.72、1.38±0.65、0.84±0.47g。免疫組織化學(xué)檢測(cè)不同濃度Genistein作用小鼠腫瘤后ALDH1的表達(dá),結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組ALDH1的表達(dá)明顯下降。
4.Western Blot和real-time PCR分別檢測(cè)蛋白水平和基因水平的Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵分子SHH、PTCH1、SMO、GLI1的表達(dá)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組在蛋白水平和基因水平的表達(dá)均顯著低于對(duì)照組。
結(jié)論:
1.
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