NF-κB信號(hào)通路對(duì)RNA結(jié)合蛋白QKI的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其在骨骼肌中的功能研究.pdf

1、NF-κB作為B細(xì)胞中κB輕鏈表達(dá)的調(diào)控元件，其家族的功能和調(diào)控是20年來(lái)研究的熱點(diǎn)。免疫系統(tǒng)識(shí)別抗原并通過(guò)NF-κB傳遞信息，由NF-κB失調(diào)引發(fā)的疾病等相關(guān)研究進(jìn)展，使得這個(gè)可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注。大量的研究工作使得NF-κB途徑成為了解的較為透徹的信號(hào)通路，并被廣泛應(yīng)用于其他研究系統(tǒng)；而NF-κB本身也成為不同領(lǐng)域研究思想的融合點(diǎn)。可誘導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控是正常生理的核心元素，也是多細(xì)胞有機(jī)體適應(yīng)環(huán)境及機(jī)械、化學(xué)和微生物

2、脅迫能力的關(guān)鍵。由于其可研究性和對(duì)疾病的重要性，NF-κB途徑成為可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子協(xié)調(diào)產(chǎn)生的細(xì)胞、組織及有機(jī)體水平應(yīng)答的模型。
　　QKI是一種RNA結(jié)合蛋白，對(duì)其功能認(rèn)識(shí)尚不深入。組織特異性表達(dá)降低QKI導(dǎo)致神經(jīng)髓鞘發(fā)育障礙，ENU誘導(dǎo)QKI純合突變的小鼠出現(xiàn)胚胎致死。目前對(duì)QKI的研究大多集中在神經(jīng)系統(tǒng)中，它參與少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化而影響神經(jīng)髓鞘的形成。深入的機(jī)制探討發(fā)現(xiàn)QKI結(jié)合MBP、MAG等髓鞘發(fā)育重要分子的3’UTR，改變

3、mRNA的定位和穩(wěn)定性，從而改變其蛋白表達(dá)水平參與髓鞘的形成。
　　從分子生物學(xué)的角度更深入地了解一個(gè)蛋白質(zhì)的功能，首先可以從其受到的調(diào)節(jié)機(jī)制入手。通過(guò)生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)在QKI的啟動(dòng)子區(qū)域，ATG上游的710bp處存在一個(gè)非常保守的NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)NF-κB信號(hào)通路對(duì)QKI具有調(diào)控作用。為了證實(shí)這一調(diào)控作用的存在，我們首先構(gòu)建了包含QKI基因啟動(dòng)子區(qū)域，atg上游2056個(gè)堿基的熒光素酶載體。通過(guò)熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)

4、的分析，發(fā)現(xiàn)NF-κB信號(hào)通路的活性亞基P65和外源活化因子TNF-α可以下調(diào)QKI啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，提示我們NF-κB下調(diào)QKI的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)半定量RT-PCR檢測(cè)TNF-α刺激C2C12和原代培養(yǎng)的新生大鼠的骨骼肌細(xì)胞后QKI的mRNA的表達(dá)變化，得到TNF-α的刺激可以在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)QKI的表達(dá)。為了進(jìn)一步說(shuō)明TNF-α的刺激是通過(guò)NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮轉(zhuǎn)錄下調(diào)QKI的功能以及確認(rèn)NF-κB信號(hào)通路對(duì)QKI的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，我們采用TNF

5、-α活化NF-κB通路特異性的抑制劑BAY11-7082以及干預(yù)NF-κB通路中重要分子的方式，證明了NF-κB確實(shí)對(duì)QKI具有轉(zhuǎn)錄下調(diào)的功能。之后，通過(guò)CHIP試驗(yàn)證明了NF-κB信號(hào)通路中的活化亞基P65可以與QKI的啟動(dòng)子區(qū)域直接的結(jié)合，而其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制的機(jī)制可能與HDACs的相互作用有關(guān)。
　　為了研究NF-κB對(duì)QKI下調(diào)在骨骼肌中的功能，我們首先探討了QKI在C2C12細(xì)胞中的功能。通過(guò)干預(yù)QKI的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)QKI

6、既有抑制C2C12細(xì)胞增殖的功能又有抑制C2C12細(xì)胞分化的功能。由于在C2C12細(xì)胞中過(guò)表達(dá)QKI后reserve細(xì)胞的marker分子P130的明顯上升，說(shuō)明上述QKI對(duì)肌肉細(xì)胞產(chǎn)生的影響是通過(guò)促進(jìn)reserve細(xì)胞的形成實(shí)現(xiàn)的。在我們誘導(dǎo)C2C12分化后，我們通過(guò)分步消化法得到reserve細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其中QKI的表達(dá)豐度高于分化成熟的myotube。由于reserve細(xì)胞與成體肌肉干細(xì)胞的特性非常相似，所以我們認(rèn)為NF-κB信號(hào)通