禽類多瘤病毒晚期基因多順反子翻譯起始調(diào)控的初步研究.pdf

1、為了研究禽類多瘤病毒（Avian polyomavirus,APV）晚期基因多順反子翻譯起始調(diào)控機(jī)制，Agno-1a前導(dǎo)蛋白對(duì)下游VPs蛋白合成的調(diào)控機(jī)制的影響作用。設(shè)計(jì)構(gòu)建一系列新型cDNA重組病毒，在agno-1a mRNA編碼序列的ATG區(qū)域，設(shè)計(jì)插入一個(gè)和插入兩個(gè)含有ATG的最佳翻譯起始信號(hào)的7個(gè)氨基酸in-frame片段。在agno-1a編碼mRNA序列的ATG區(qū)域，設(shè)計(jì)PCR點(diǎn)突變，使起始密碼子ATG變成ACG或CTG，從而

2、關(guān)閉agno-1a的翻譯并可能改變關(guān)鍵mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，形成ATG突變型重組克隆。片段插入型克?。篠DS堿裂解法，提取APV cDNA克隆pHL1003質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶Acc I部分酶切，得到回收的載體片段，人工合成的27bp DNA并磷酸化的目的片段，經(jīng)T4連接酶與載體片段連接，篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，得到片段插入型 cDNA克隆 pHL1003+1、pHL1003+2。點(diǎn)突變型克?。河孟拗菩詢?nèi)切酶 Nco I完全酶

3、切和Acc I部分酶切pHL1003質(zhì)粒DNA，得到載體片段，設(shè)計(jì)PCR點(diǎn)突變起始密碼子ATG變?yōu)锳CG和CTG的目的片段，與載體片段連接，篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證。設(shè)計(jì)構(gòu)建GFP為下游報(bào)告基因熒光標(biāo)記的APV-1晚期基因真核雙順反子表達(dá)載體，以 EGFP報(bào)告基因替代野生型病毒 APV-1編碼晚期結(jié)構(gòu)蛋白 VPs基因的堿基序列。pHL1003質(zhì)粒DNA為模板，PCR擴(kuò)增出與野生型病毒APV-1相同的Ori區(qū)、早期編碼區(qū)和晚期 agno-1a

4、區(qū)序列,作為載體片段，載體片段黏性末端補(bǔ)齊平末端連接后，得到重組質(zhì)粒pHL1003-1(可作為Agno-1a蛋白表達(dá)質(zhì)粒)。質(zhì)粒DNA pEGFP-N1為模板， PCR擴(kuò)增出編碼綠色熒光蛋白的EGFP片段，作為目的片段與上述載體片段經(jīng)T4連接酶連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒pHL1003-GFP，測(cè)序驗(yàn)證。用限制性內(nèi)切酶NruI和NedI雙酶切 pHL1003+1、pHL1003+2和 pHL1003-GFP，得到目的片段和載體片段連接，構(gòu)建pHL

5、1003+1-GFP，pHL1003+2-GFP克隆。
　　本研究通過(guò)磷酸鈣和脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染方法，將構(gòu)建的cDNA突變型質(zhì)粒DNA，分別定量轉(zhuǎn)染到雞胚和鵪鶉胚胎成纖維細(xì)胞中，分別利用Western blot和熒光顯微鏡觀察檢驗(yàn)。Western blot結(jié)果顯示出部分特異性條帶，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染72 h后的雞胚和鵪鶉胚胎成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功胚胎細(xì)胞明顯表達(dá)較強(qiáng)的熒光。結(jié)果表明，GFP熒光標(biāo)記的APV-1真核雙順反子 cDNA表達(dá)載體