HSP70在大鼠腎缺血再灌注損傷中的表達(dá)及活血化瘀中藥干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的缺血再灌注損傷(Ischemia/Reperfusion Injury， IRI)是臨床上一種常見的病理生理現(xiàn)象，腎臟作為高灌注器官，非常容易發(fā)生IRI，臨床上因?yàn)镮RI而導(dǎo)致的急性腎功能衰竭(Acute Renal Failure，ARF)的現(xiàn)象非常多見，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，且無很好的防治手段。腎缺血再灌注損傷時(shí)的病理生理變化一直是許多學(xué)者研究的重點(diǎn)。本研究通過制作大鼠腎缺血再灌注損傷模型，研究急性腎缺血后不同再灌注時(shí)間熱休克

2、蛋白70(heat shock protein70，HSP70)的表達(dá)規(guī)律及其對(duì)腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，研究活血化瘀中藥對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷時(shí)熱休克蛋白70表達(dá)的影響，探索藥物誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生熱休克蛋白70的可行性。 方法 1、實(shí)驗(yàn)分組：普通級(jí)雌性SD大鼠108只，體重200±20g隨機(jī)分為三組。A組(完全空白組)：36只，按照再灌注0、6、12、24、36、48小時(shí)隨機(jī)分6小組，每組6只，分離左右兩側(cè)腎蒂，但不阻斷腎供血。B

3、組(生理鹽水組)：36只，建立雙側(cè)腎蒂夾閉45分鐘的大鼠缺血再灌注模型，按照再灌注0、6、12、24、36、48小時(shí)隨機(jī)分6小組，每組6只。手術(shù)前5-10分鐘從股靜脈注射生理鹽水0.5ml/0.1kg。C組(活血化瘀中藥組)：36只，建立雙側(cè)腎蒂夾閉45分鐘的大鼠缺血再灌注模型，按照再灌注0、6、12、24、36、48小時(shí)隨機(jī)分6小組，每組6只。手術(shù)前5-10分鐘從股靜脈注射活血化瘀中藥0.5ml/0.1kg，活血化瘀中藥為血必凈由天津

4、紅日藥業(yè)生產(chǎn)，其主要成份：紅花、赤芍、丹參、當(dāng)歸、川芎。2、動(dòng)物模型制作：所有手術(shù)采取配對(duì)方式進(jìn)行。手術(shù)采用4﹪水合氯醛0.875ml/0.1kg腹腔注射麻醉，劍突至恥骨聯(lián)合正中切口。開腹游離左、右腎，充分顯露腎蒂，無損傷動(dòng)脈夾夾閉腎蒂阻斷腎血流45min后，松開動(dòng)脈夾。手術(shù)過程中觀察腎臟顏色變化，夾閉成功后腎臟顏色變成暗紅至暗黑色，打開動(dòng)脈夾則短時(shí)間內(nèi)迅速再灌注充血恢復(fù)為鮮紅色。3、標(biāo)本取材： (1)造模前10分鐘及缺血再灌注結(jié)束時(shí)取

5、血待測(cè)肌酐、尿素氮。 (2)根據(jù)不同再灌注時(shí)間點(diǎn)結(jié)束時(shí)取一側(cè)腎放于液氮罐中保存，后放于-80℃冰箱待免疫印跡檢測(cè)使用；另一側(cè)腎立即置于10﹪福爾馬林溶液固定24小時(shí)，常規(guī)石蠟包埋，存于-4℃冰箱待做HE染色病理切片及免疫組化使用。4、結(jié)果檢測(cè)： (1)檢測(cè)A、B、C三組造模前及不同再灌注時(shí)間點(diǎn)的血肌酐及尿素氮的變化。(2)病理切片HE染色光鏡及電鏡照片。 (3)利用免疫印跡方法定量檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組不同再灌注時(shí)間點(diǎn)HSP70的表達(dá)。 (4)免

6、疫組織化學(xué)方法定性檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組不同再灌注時(shí)間點(diǎn)HSP70的表達(dá)。結(jié)果 1、血肌酐及尿素氮：A組與B組再灌注6小時(shí)以上組腎功能改變差異顯著(p<0.05)，表明腎缺血再灌注損傷后出現(xiàn)急性腎功能不全；A組與C組差異不顯著(p>0.05)，表明腎缺血再灌注損傷后中藥干預(yù)組腎功能破壞不顯著；B組與C組再灌注6小時(shí)以上組差異顯著(p<0.05)，表明活血化瘀中藥有對(duì)抗腎缺血再灌注損傷并保護(hù)腎功能的作用。2、病理切片HE染色光鏡及電鏡照片：B組與A

7、組對(duì)比表明，腎缺血再灌注損傷后腎臟病理改變明顯；C組與B組及A組對(duì)比腎缺血再灌注損傷后腎臟病理改變減輕，表明活血化瘀中藥減輕了腎臟病理損害。3、免疫組化法定位：可見C組HSP70在細(xì)胞漿表達(dá)量較B組顯著。4、Western blot結(jié)果：與A組對(duì)比B、C組HSP70的表達(dá)隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)而不斷增加，B組HSP70在再灌注24h表達(dá)達(dá)到高峰，C組HSP70表達(dá)在再灌注12h較B組提前達(dá)到高峰，表明活血化瘀中藥誘導(dǎo)HSP70表達(dá)提前達(dá)高峰發(fā)