孕婦血漿中胎兒DNA和比較基因組雜交技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用研究.pdf

1、本研究分為二部分。第一部分為定性研究。通過對O型血孕婦血漿中游離胎兒。DNA進行定性檢測，以探討利用孕婦外周血中游離胎兒DNA進行無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷胎兒ABO血型的可行性。第二部分為定量研究。利用實時定量PCR技術(shù)，對妊娠21三體孕婦和唐氏高危孕婦及正常孕婦的血漿中DNA進行定量檢測，目的是尋找一種無創(chuàng)性、快捷、經(jīng)濟的產(chǎn)前篩查唐氏綜合征胎兒的新方法；同時探討游離胎兒DNA的來源和含量變化的機制，以便為游離胎兒DNA更好地應(yīng)用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷

2、奠定基礎(chǔ)。 目的：本研究通過提取O型血孕婦血漿中的游離DNA，利用PCR-SSP 技術(shù)對胎兒ABO血型基因型進行了無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的研究，目的是探討這一無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷方法的可行性和準(zhǔn)確性。 方法：選擇孕中晚期單胎O型血孕婦105例，其丈夫血型為非O型。采用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取孕婦血漿中游離DNA；采用QIAamp DNA BloodMaxi Kit提取臍血基因組DNA，PCR-SSP方法檢

3、測ABO血型基因型，基因分型采用A1.2BO1.2方法。同時對夫婦雙方及其新生兒用傳統(tǒng)的血清學(xué)方法檢測其ABO血型表現(xiàn)型。在利用游離DNA獲得胎兒血型結(jié)果之前，對新生兒的血型表現(xiàn)型是未知的。 結(jié)果：(1)利用臍血DNA，105例孕婦新生兒血型經(jīng)PCR-SSP方法均正確診斷。(2)利用孕婦血漿中游離DNA，93例胎兒血型基因型與臍血DNA血型基因型相符，即診斷符合率為88.6％(93/105)。12例血型產(chǎn)前診斷不符的胎兒均來自于

4、66例妊娠非O型血胎兒的孕婦；39例妊娠O型血胎兒的孕婦的胎兒血型基因型均正確檢出。另外，孕中期的診斷符合率低于孕晚期。(3)5例經(jīng)產(chǎn)婦本次妊娠胎兒血型與以前子女血型不同，但利用孕婦血漿中游離DNA均能準(zhǔn)確檢測。 結(jié)論：利用O型血孕婦血漿中游離DNA進行無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷胎兒.ABO血型是一種可行途徑，PCR-SSP方法檢測ABO血型基因型結(jié)果可靠，且簡單快捷.易于操作，值得在母兒血型不合和新生兒溶血病的預(yù)防、診斷等應(yīng)用、推廣。

5、 目的：本研究擬采用TagMan探針實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)技術(shù)，通過測定妊娠DS胎兒孕婦和唐氏高危孕婦血漿中游離胎兒DNA含量，尋找一種無創(chuàng)性的產(chǎn)前篩查DS的新方法；同時，通過觀察游離胎兒DNA含量與孕婦血β-HCG濃度的關(guān)系，對孕婦血漿中游離胎兒DNA的組織來源以及含量變化的機制作深入的探討，為游離胎兒DNA更好的應(yīng)用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷奠定基礎(chǔ)。 方法：選擇妊娠DS男胎孕婦5例；唐氏高危孕婦39例

6、，其中孕男胎孕婦21例；唐氏低危正常孕婦42例，其中孕男胎孕婦22例。OIAamp Blood DNA MiniKit提取孕婦血漿中游離DNA，采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定孕婦血清β-HCG值，Real-time PCR定量檢測孕婦血漿中游離DNA含量，其中DYS14基因和β-actin基因分別代表孕婦血漿中胎兒DNA和孕婦血漿總DNA。通過組間可比性控制，比較正常妊娠組、妊娠DS組婦女及唐氏篩查高危孕婦血漿中游離胎兒DNA的含量，同時對

7、孕婦的血漿中胎兒DNA含量與血β-HCG濃度進行Pearson相關(guān)分析。 結(jié)果：(1)建立了Real-time PCR檢測DYS14基因及β-actin基因定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)Real-time PCR方法檢測DYS14基因的敏感性和特異性均為100％。(3)妊娠DS男胎孕婦血漿中胎兒DNA含量127.4±58.4 GE/ml是正常男胎孕婦48.5±20.8-GE/ml的3.1倍，是唐氏高危男胎孕婦78.4±28.0GE/ml的

8、1.4倍，唐氏高危男胎孕婦血漿中胎兒DNA含量也明顯高于正常男胎孕婦，以上兩兩比較，經(jīng)t檢驗差異具有顯著性(P＜0.01)；妊娠DS男胎孕婦、唐氏高危男胎孕婦和正常男胎孕婦三組之間，經(jīng)兩兩比較，其血漿中總DNA含量無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。(4)妊娠DS男胎孕婦血β-HCG濃度96.8±42.9 1IU/ml明顯高于唐氏高危男胎孕婦58.1±25.3 IU/ml和正常男胎孕婦38.1±19.4 IU/ml，唐氏高危男胎孕婦血β-HC

9、G濃度也明顯高于正常男胎孕婦，兩兩比較，經(jīng)t檢驗差異具有顯著性(P＜0.01)。(5)孕婦的血漿中胎兒DNA含量與血β-HCG濃度兩者相關(guān)且具有統(tǒng)計學(xué)極顯著性意義(r=0.86，P＜0.0001)。結(jié)論：(1)Real-time PCR技術(shù)具有敏感、特異、快速、操作簡便、高通量等優(yōu)點，適合于臨床大規(guī)模產(chǎn)前篩查及診斷，利用其進行無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷胎兒性別的靈敏度和特異性可達(dá)100％。(2)孕婦血漿中的游離胎兒DNA的定量檢測可以作為產(chǎn)前篩查D

10、S的候選指標(biāo)。(3)胎兒DNA含量需聯(lián)合其它指標(biāo)才能有效地反映胎兒的發(fā)育情況，才可以作為唐氏篩查的有效診斷手段。(4)β-HCG是唐氏篩查的敏感標(biāo)志物之一。(5)游離胎兒DNA升高與血β-HCG變化密切相關(guān)，本文在國內(nèi)首次提出合體滋養(yǎng)層細(xì)胞是孕婦血漿中游離胎兒DNA主要來源，DS妊娠孕婦血漿中胎兒DNA異常升高的發(fā)病機制為合體滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡增加、破壞后釋放進入母血循環(huán)所造成。 目的：本研究通過對CGH技術(shù)進行改進，擬建立方便實用

11、的CGH方法路線，即熒光互換CGH。并采用這一技術(shù)對部分產(chǎn)前篩查高危病例及畸形胎兒進行產(chǎn)前胎兒染色體檢查，通過與傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)果比較，以檢驗其敏感性和可靠性。為產(chǎn)前診斷胎兒染色體異常提供一個更好的有益的手段，以提高圍產(chǎn)兒優(yōu)生率，同時為更好的認(rèn)識和分析畸形胎兒的病因機制奠定基礎(chǔ)。同時這一技術(shù)平臺的建立對于下一步利用CGH更好的開展胚胎植入前遺傳學(xué)診斷以及應(yīng)用母體外周血中胎兒細(xì)胞進行無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷胎兒染色體異常都具有很深的意義。

12、方法：選取唐氏綜合征篩查結(jié)果為高風(fēng)險并且細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)果異常的孕婦5例，因胎兒畸形、死胎引產(chǎn)的孕婦12例。采用Tiangen DNA抽提試劑盒提取研究對象羊水或臍血基因組DNA，Vysis缺口平移試劑盒標(biāo)記待測DNA和對照DNA，每份樣本均分別標(biāo)記SpectrumGreen和SpectrumRed。將等量的SpectrumGreen標(biāo)記的待測DNA、SpectrumRed標(biāo)記的正常對照DNA與Cot-1 DNA混勻、沉淀、制成混合探針，加

13、至正常中期染色體玻片的雜交區(qū)域，73℃共變性，37℃雜交48-72小時，然后洗片、復(fù)染，熒光顯微鏡進行中期染色體分裂相的選擇、攝像。同時進行熒光互換CGH:將待測DNA和對照DNA的熒光顏色互換，即SpectrumRed標(biāo)記待測DNA、SpectrumGreen標(biāo)記正常對照DNA。最后使用CGH軟件進行圖像分析，根據(jù)綠紅兩種信號的比值，即每一染色體上的熒光強度比制作CGH拷貝數(shù)核型模式圖，以1.0表示平衡比例，F(xiàn)R閾值定為1.25和0.

14、75，三體或染色體片段的擴增定義為FR＞1.25，1.5以上視為高水平擴增；單體或染色體片段的缺失定義為FR＜0.75。細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)果在CGH實驗分析結(jié)束后知曉。 結(jié)果：(1)本實驗建立的CGH方法雜交效果好，染色體涂染均勻，背景干凈。來自17例入選孕婦的胎兒樣本均成功的利用熒光互換CGH方法進行了分析、確認(rèn)。(2)熒光互換CGH共檢出21三體3例，18三體和45，XO各1例，與細(xì)胞遺傳學(xué)分析結(jié)果完全一致。2例CGH和細(xì)胞遺傳學(xué)

15、分析均未發(fā)現(xiàn)染色體缺失或擴增，其中1例為Dandy-Walker畸形。(3)1例細(xì)胞遺傳學(xué)分析僅能判斷4號染色體的長臂遠(yuǎn)端部分缺失，而熒光互換CGH發(fā)現(xiàn)該病例是4號染色體4q32-qter的缺失，其核型為46，XY，Del 4q32-qter。(4)9例孕婦由于羊水/臍血太少或死胎致培養(yǎng)失敗等原因未能進行細(xì)胞遺傳學(xué)分析，其中3例CGH檢測出染色體不平衡并通過熒光互換CGH得到了確認(rèn)。1例CGH核型為Dup 21，初步考慮該患兒核型為21

16、三體，但在熒光互換CGH中僅檢測到了21q的擴增；1例熒光互換CGH證實核型為Del 2p24-pter，Dup 12p13；1例在排除了22p異染色質(zhì)區(qū)域的雜交偏移后，其CGH核型為Del 1p33-pter，Del 22q11-12，結(jié)合臨床考慮為腭-心-面綜合征。 結(jié)論：(1)在CGH流程中有諸多因素會影響最終的分析結(jié)果，熒光互換CGH能夠最大程度的排除在實驗過程中可能產(chǎn)生的誤差，同時對變性方法進行改善，大大增加了染色體異

17、常病例檢出的準(zhǔn)確性和可靠性。目前這一方便實用的熒光互換CGH路線系本文首次報道。(2)熒光互換CGH可靠準(zhǔn)確，為更好地產(chǎn)前診斷胎兒染色體異常提供了一個有益的手段，特別是對于傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)無法進行分析時尤有意義，而且較傳統(tǒng)細(xì)胞核型分析更加靈敏，可以作為產(chǎn)前診斷中傳統(tǒng)核型分析的有益和必要補充。(3)染色體某些片段的異常與胎兒某種畸形有對應(yīng)關(guān)系，染色體異常是胎兒畸形的重要病因之一，但是部分畸形如Dandy-Walker等并非染色體異常。