新型放射增敏劑CpG ODN107的臨床前藥代動力學研究.pdf

1、腦膠質瘤(gliomas)是世界上發(fā)病率最高的腦腫瘤，發(fā)病率為十萬分之十二。由于腦惡性膠質瘤浸潤性很強，手術切除率很低，術后高復發(fā)，臨床上的標準治療方法是采用手術切除加術后放射治療。但是，由于大多數(shù)膠質瘤對放射線不敏感或者放射治療一段時間后對放射線的敏感性降低，即使提高照射劑量仍不能取得滿意療效。因此，研制高效的放射增敏劑，增加射線對腫瘤細胞的殺傷作用，對提高腦膠質瘤的治愈率、延長生存期具有重要意義。
　　 含有未甲基化CpG的

2、寡核苷酸片段(CpG oligonucleotides，CpG ODN/CpG DNA)是具有免疫激活作用的寡核苷酸，有文獻報道，CpG ODN可以提高肺癌、惡性腦膠質瘤組織對化療和放療的敏感性，可增加單次放療和分次放療中射線對腫瘤的殺傷作用，具有化療和放射增敏作用。含12個堿基的硫代寡核苷酸CpG ODN107(CpGoligonucleotide107，5'-TGGCGCGGGGCG-3')是本實驗室經(jīng)早期篩選的對腫瘤有放射增敏作用

3、的CpG ODN。CpG ODN107在體內、外的藥效學研究均表明CpG ODN107聯(lián)合射線可抑制腫瘤生長，誘導腦膠質瘤細胞白噬性死亡，延長動物生存時間。CpGODN107作為治療腦膠質瘤新型放射增敏劑，合成方法簡單、毒性低、質量可靠、放射增敏效果顯著，研發(fā)成功將為腦膠質瘤患者帶來福音，并將產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。
　　 本研究項目是國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項“放射增敏劑候選藥物CpGODN107的研究”(2009

4、ZX09103-051)的重要研究內容之一，通過研究CpG ODN107在動物體內的吸收、分布、代謝、排泄過程，闡明其在動物體內的藥代動力學特征，為該藥物的藥效學、毒理學研究以及臨床新藥報批提供資料，同時也為其他此類化合物的藥代動力學研究提供方法參考和新的研究思路。
　　 主要研究內容與方法：
　　 一、生物樣品中CpG ODN107及其代謝物的檢測方法建立
　　 通過優(yōu)化和改良色譜和質譜條件，建立高效液相色譜-

5、三重四級桿質譜聯(lián)用(LC-MS/MS)的方法測定血漿中CpG ODN107及其代謝物(鏈縮短序列3'N-1、3'N-2、3'N-3和5'N-1)的濃度，并進行方法學確證，包括方法的專屬性、靈敏度、定量線性范圍、日內及日間精密度、準確度、回收率、樣品穩(wěn)定性和基質效應的考察。在此基礎上，針對不同生物樣本，如尿、糞、膽汁和組織均漿液，進行藥物提取方法的再優(yōu)化，建立不同生物樣品中CpG ODN107藥物濃度的測定方法，并進行部分方法學確證。

6、r>　　 二、CpG ODN107及其代謝物的血漿動力學特征
　　 描繪小鼠單次靜脈注射四個劑量(2.5、5、10和15 mg/kg)的CpG ODN107血藥濃度-時間曲線圖，以及小鼠單次靜脈注射15mg/kg CpG ODN107的代謝物的血藥濃度-時間曲線圖，采血時間點為給藥前和給藥后2 min、5 min、15 min、30 min、60 min、120 min、180 min、240 min、360 min、540

7、min和720 min；通過房室模型擬合和統(tǒng)計矩的方法計算CpG ODN107在四個給藥劑量以及代謝物在15mg/kg給藥劑量下的相關藥代動力學參數(shù)；確定CpG ODN107在四個給藥劑量是否存在AUC和Cmax依賴于成正比增高的線性藥代動力學。
　　 三、CpG ODN107的分布特征
　　 ①選擇高、中、低三個劑量濃度的藥物分別與空白小鼠、人血漿以及人血清白蛋白、等孵育，采用超過濾法，經(jīng)LC-MS/MS檢測含量，研究

8、CpG ODN107與不同種屬血漿蛋白的結合情況；②選擇5 mg/kg劑量組，小鼠尾靜脈注射給藥，在給藥后0.5h、1 h、2 h、4 h、10 h、24 h處死，解剖，提取肝、心、腦、脾、肺、腎、腸、肌肉、生殖腺等重要組織、器官藥物，LC-MS/MS藥測定物濃度，研究CpG ODN107在各組織器官中的分布特征；③腦內注射熒光標記的CpG ODN107，通過小動物活體熒光成像方法研究CpG ODN107在腦中的分布特征。
　　

9、 四、CpG ODN107的排泄特征
　　 選擇5 mg/kg的給藥劑量，經(jīng)尾靜脈注射，在小鼠體內分段收集24 h的糞、尿；選擇3.5 mg/kg的給藥劑量，經(jīng)尾靜脈注射，在大鼠體內分段收集24 h的糞、尿和膽汁；生物樣品經(jīng)處理后LC-MS/MS測定藥物的濃度，研究CpG ODN107在尿、糞和膽汁中的排泄特征。
　　 主要研究結果：
　　 一、生物樣品中CpG ODN107及其代謝物的LC-MS/MS檢測方法建

10、立和確證
　　 優(yōu)化了CpG ODN107及其代謝物的LC-MS/MS測定條件；改進在血漿和組織中CpG ODN107的提取方法，血漿、尿、糞、膽汁樣本經(jīng)酚仿液-液萃取結合固相萃取提取藥物，組織樣本經(jīng)DNA提取試劑盒去除內源性核苷酸后再經(jīng)固相萃取提取藥物；以15個T堿基構成的硫代序列為內標，以乙腈：0.05％氨溶液=20:80為流動相，分析柱為Extend C18柱(150 mm×2.1 mm，3.5μm)，以高純氮氣作為干燥氣

11、，ESI源負離子掃描，MRM檢測方式進行檢測。CpG ODN107在血漿中20～5000 ng/mL濃度范圍內線性關系良好，在尿、膽汁中20～4000 ng/mL濃度范圍內線性關系良好，在組織中0.1～40μg/g濃度范圍內線性關系良好。3'N-1、3'N-2、3'N-3和5'N-1四種代謝物在血漿中10～2500 ng/mL濃度范圍內線性關系良好。本方法專屬性強、線性關系良好，靈敏度、精密度、準確度均符合《化學藥物非臨床藥代動力學研究

12、技術指導原則》的要求，可進行體內藥物分析。
　　 二、CpG ODN107以及代謝物的血漿動力學特征
　　 小鼠單次靜脈注射四個劑量(2.5、5、10和15 mg/kg)CpG ODN107后，經(jīng)DAS軟件進行房室模型擬合，結果表明CpG ODN107在小鼠體內藥動學過程符合靜脈注射的三室模型；統(tǒng)計矩法計算得到平均滯留時間MRT(0-t)分別為48.37、58.94、54.19和53.74min；CL分別為0.013、0

13、.012、0.013和0.005 L/min/kg；梯形法計算得到的藥時曲線下面積AUC(0-t)分別為185974.8，412136.3和732853.5 ng/mL*min。AUC0-t和Cmax的線性分析結果表明，CpG ODN107在小鼠體內呈現(xiàn)非線性動力學的特征。
　　 小鼠單次靜脈注射15 mg/kg CpG ODN107后，在血漿中很快檢測到3'N-1、3'N-2、3'N-3和5'N-1四種代謝物，其AUC(0-t

14、)分別為215957.9、116663.0、64572.2和105595.5ng/mL*min，MRT(0-t)分別為35.2、78.0、118.2和70.3 min。采用AUCm/AUCp表示代謝物相當量，3'N-1、3'N-2、3'N-3和5'N-1分別為6.93％，3.75％，2.07％和3.39％，血漿中主要代謝物為3'N-1。
　　 三、CpG ODN107的分布特征
　　 ①采用超濾法分別測定了CpG ODN

15、107與人、小鼠血漿以及人血漿白蛋白(HAS)的蛋白結合率，結果表明CpG ODN107與各種屬來源的血漿蛋白結合率均較高(>96％)。CpG ODN107與HAS的結合率>90％，說明在人血漿中主要與白蛋白結合，并且隨著藥物濃度的增加，與白蛋白的結合出現(xiàn)飽和現(xiàn)象。
　　 ②小鼠5 mg/kg尾靜脈注射CpG ODN107后，主要分布在肝、腎和脾組織。CpGODN107按在給藥0→24h的AUC排序由大到小依次為：肝>腎>脾>肌

16、肉>心>肺>睪丸>腸>腦。在腦組織中未檢測到CpG ODN107，說明其不容易通過血腦屏障。從整個分布情況看，CpG ODN107在肝中濃度較其他組織高，分布與消除均較快；給藥后1小時，CpG ODN107在腎脾中的分布在1小時最多，可能與其在腎臟中排泄有關；CpG ODN107在心、肌肉、肺、腸和睪丸組織中分布均較低，在肺中消除最慢。
　　 ③小鼠0.25 mg/kg腦內注射CpG ODN107后，藥物主要分布在進針位置，4h

17、可觀察到CpG ODN107擴散到整個腦組織，給藥48h后仍未完全消除。
　　 四、CpG ODN107的排泄特征
　　 研究結果表明，該藥是以原型藥物和縮短的寡核苷酸的形式從小、大鼠體內排泄掉，尿排泄為主要排泄途徑。靜脈給藥24h內，CpG ODN107在小鼠尿和糞中總共排泄的全長序列的量占總給藥量的2.70％，尿和糞分別為1.79％，0.91％，以尿排泄為主；CpG ODN107在大鼠尿和糞中總共排泄的全長序列的量占

18、總給藥量的0.84％，尿和糞分別為0.63％，0.21％，以尿排泄為主；大鼠膽汁中均未檢測出CpG ODN107。
　　 研究結論：
　　 1.建立了多種生物樣品中CpG ODN107和代謝物含量的LC-MS/MS的測定方法。所建方法專屬性強、線性關系良好、靈敏度、精密度和準確度均能滿足藥代動力學研究的要求。
　　 2.CpG ODN107在小鼠體內的藥代動力學性質符合三室模型，在體內消除過程屬于非線性藥代動力學

19、；3'N-1是血漿中主要代謝物，代謝物的在血漿中動力學變化趨勢與原型藥物相似。
　　 3.CpG ODN107與不同種屬來源的血漿蛋白結合大于96％，主要與白蛋白結合，隨藥物濃度增加結合呈現(xiàn)飽和性；血管內給藥后CpG ODN107主要分布在肝、腎和脾組織，分布與消除快，腦中未見分布；腦內給藥后，CpG ODN107主要分布在給藥部位的腦組織，且消除慢。
　　 4.CpG ODN107在小鼠、大鼠體內，藥物以原型藥和鏈縮短