中藥比較藥代動(dòng)力學(xué)研究思路與應(yīng)用宋敏

1、1,中藥比較藥代動(dòng)力學(xué)研究思路與應(yīng)用,宋敏博士 副教授 藥物分析教研室 中國(guó)藥科大學(xué),2,中藥研究現(xiàn)狀,中藥研究熱點(diǎn)：質(zhì)量控制、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)質(zhì)量控制：DNA分子標(biāo)記技術(shù)建立部分動(dòng)物藥的鑒別方法采用生物自顯影技術(shù)、細(xì)胞膜技術(shù)、生物活性測(cè)定等生物方法建立藥材的定性鑒別和定量分析方法采用“一標(biāo)多測(cè)”技術(shù)建立多成分含量測(cè)定方法；采用指紋圖譜分析法建立部分藥材的整體質(zhì)量控制方法 --逐步由單一指標(biāo)性成分定性定量向活性、有效成分及

2、生物測(cè)定的綜合檢測(cè)過渡,3,中藥藥代動(dòng)力學(xué)∈藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究目前，研究手段大多與化學(xué)藥物相類似，針對(duì)已知活性成分單體進(jìn)行研究，但單味中藥即是一個(gè)化學(xué)分子庫(kù)，且有效成分不甚明確，相互間可能存在的影響關(guān)系不明確。the kava extract increased the oral bioavailability of kawain in rat which was also the main cause of the adverse

3、drug reaction Pharmacokinetics and disposition of the kavalactone kawain:interaction with kava extract and kavalactones in vivo and invitro. Drug. Metab. Dispos. 2005, 33, 1555–1563.,中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究現(xiàn)狀,4,中藥藥代動(dòng)力學(xué)∈藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究中藥中化學(xué)

4、成分存在相互影響The coexisting ingredients in Gentiana manshurica had remarkable influence on the pharmacokinetics of gentiopicrinStudies on pharmacokinetics of gentiopicrin in longdan and its compound preparation in rats. Chi

5、n. Pharm. J. 2003, 40, 212–215.,中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究現(xiàn)狀,5,中藥藥代動(dòng)力學(xué),有效成份單體與其在中藥提取物中的體內(nèi)過程并不一致，勢(shì)必在藥理作用上得以體現(xiàn)Such as dihydrotanshinone and cryptotanshinone were less active in acetylcholinesterase inhibitory when isolatedRen, Y.H., Pete

6、r, J.H., Robert, C.H., Melanie-Jayne, R.H., 2004. Novel diterpenoid acetylcholinesterase inhibitors from Salvia miltiorrhiza. Planta Med. 2004, 70, 201–204.,6,中藥藥代動(dòng)力學(xué),藥理作用差異salvinolic acid B, which is the main hydrophil

7、ic component in S. miltiorrhiza Bge., showed lower effective concentration in in vitro angiogenesis study than the crude extract Crude extract of Salvia miltiorrhiza and salvianolic acid B enhance in vitro angiogenesis

8、in murine SVR endothelial cell line. Planta Med. 2003, 69, 26-32中草藥間的相互配伍反應(yīng)及與其他藥物的相互作用日益得到重視，但仍需進(jìn)一步研究,7,挖掘丹參藥材中共存組份之間可能存在的相互影響情況，認(rèn)識(shí)丹參藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為臨床用藥提供指導(dǎo)，為新藥開發(fā)提供理論依據(jù)。,第一部分丹參提取物有效成分比較藥代動(dòng)力學(xué),8,第一部分丹參提取物有效成分比較藥代動(dòng)力學(xué),丹參水溶性成分丹參

9、酯溶性成分,9,丹參水溶性成分:丹酚酸B和原兒茶醛,丹酚酸B：丹參水溶性成分中含量最高和藥典規(guī)定的含量測(cè)定指標(biāo)成分。原兒茶醛：丹酚酸B在體外可能的降解產(chǎn)物。,10,,實(shí)驗(yàn)條件,Thermo Finnigan Surveyor LC-TSQ Quantum Ultra AM液相色譜串聯(lián)四極質(zhì)譜系統(tǒng)(美國(guó)菲尼根質(zhì)譜公司)。色譜柱：Waters-C18 250mm?4.6mm, 5?m (預(yù)柱為C18,10mm?4.6mm,

10、5?m)；流動(dòng)相：甲醇(A)－1％冰乙酸(B) 為流動(dòng)相，梯度洗脫：0min(40％A)-4min(40％A)-4.1min(80％A)-10min(80％A) ；流速：1.0mL·min-1，柱后分流，0.3 mL·min-1進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器 ；進(jìn)樣量：20?l。,一、原兒茶醛的藥動(dòng)學(xué)研究,11,質(zhì)譜圖,Mass spectra of protocatechualdehyde (A) and interna

11、l guaiacol (B),A,B,12,A: Blank plasmaB: Protocatechualdehyde added to blank plasma, C protocatechualdehyde =200.0ng·ml-1 (tR=4.90min)C: Rat plasma sample taken 20min after ig of protocatechualdehyde, C protocate

12、chualdehyde =1002.7ng·ml-1 (tR=4.89min),A,B,C,13,藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì),Sprague-Dawley大鼠6只，雌雄各半，體重250±10g，由南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。大鼠于受試的前晚起禁食，不禁水，于灌藥4小時(shí)后給食。大鼠灌胃給藥原兒茶醛62 mg·kg-1。分別于給藥后2、5、10、15、20、30、40min和 1.0、1.5、2.0、3.0h從眼底靜脈叢

13、取血0.5mL，置肝素鈉抗凝處理過的試管中，3000 r·min-1離心10min，轉(zhuǎn)移血漿，置-20℃保存待測(cè)。,14,原兒茶醛藥－時(shí)曲線,Mean plasma concentration-time curve after ig protocatechualdehyde 62mg·kg-1 in rat,達(dá)峰時(shí)間在10～15min，而后以極快的速度消除，180min后只能測(cè)到少數(shù)大鼠的血藥濃度。,15,色譜條件與

14、質(zhì)譜條件,質(zhì)譜條件 丹酚酸B是三分子丹參素和一分子咖啡酸的縮合物，雖然在負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式下也可生成m/z717的[M-H]-，繼而經(jīng)二級(jí)碰撞脫去一分子丹參素產(chǎn)生子離子m/z519[M-198-H]-，但在相同的碰撞能量下也可生成脫去兩分子丹參素的子離子m/z321，兩者豐度相差不大，不夠穩(wěn)定如圖所示；相比較正離子監(jiān)測(cè)模式下[M+Na]＋峰m/z741較穩(wěn)定，且其子離子m/z561為脫去一分子咖啡酸后生成，豐度較強(qiáng)，因此被選用。,

15、A,B,Negative mode;B. Positive mode,二、丹酚酸B的藥動(dòng)學(xué)研究,16,丹酚酸B在大鼠體內(nèi)的藥－時(shí)曲線,Mean plasma concentration-time curve of salvianolic acid B after ig. salvianolic acid B 260mg·kg-1 in rat,17,三、丹參水溶性提取物的中丹酚酸B和原兒茶醛的藥動(dòng)學(xué),灌胃試液的配制：取

16、丹參干燥藥材粉末500g，水1000mL提取三次，每次1hour，過濾后濾液濃縮，再分別用60%, 85%和95%的乙醇沉淀鞣質(zhì)，過濾，濾液減壓濃縮至干，用適量生理鹽水溶液即得，HPLC-UV測(cè)定其中丹酚酸B含量為26mg/mL，原兒茶醛為6.2mg/mL。,18,血藥濃度經(jīng)時(shí)過程,大鼠灌胃給藥丹參水提物 （其中相當(dāng)于丹酚酸B 260mg·kg-1和原兒茶醛62mg·kg-1）后的丹酚酸B和原兒茶醛的藥－時(shí)曲線。,M

17、ean plasma concentration-time profiles of salvianolic acid B and protocatechualdehyde in rat after ig of Danshen water soluble extract,19,小結(jié)與討論,原兒茶醛：大鼠灌胃給藥原兒茶醛單體后的AUC為64754.0 ng/ml·min，而灌胃給藥含有相同含量原兒茶醛的丹參水提物后，其AUC只有2

18、5067.9 ng/ml·min，即單體給藥的AUC為提取物給藥的2.6倍，Cmax為5.1倍，MRT為0.4倍，可見原兒茶醛單體給藥時(shí)吸收較好，而消除快；以提取物方式給藥后的原兒茶醛呈一房室模型，即只在中央室少量吸收，未向周邊室分布就開始消除。,Comparison of the plasma concentration-time profiles of protocatechualdehyde,20,小結(jié)與討論,丹酚酸B：

19、以提取物方式給藥后的丹酚酸B的AUC為98904.3 ng/ml·min，是單體方式給藥后的AUC(為22569.4 ng/ml·min)的4.4倍，Cmax為3.4倍，MRT為1.5倍，即提取物方式給藥使丹酚酸B的吸收變好了，消除減慢了。可能的原因包括提取物中的并存成分促進(jìn)了丹酚酸B的吸收并減緩其消除，或其它成分的代謝轉(zhuǎn)化。,Comparison of the plasma concentration-time p

20、rofiles of salvianolic acid B,21,小 結(jié),經(jīng)過大鼠原兒茶醛和丹酚酸B的藥動(dòng)學(xué)比較研究可知，丹參藥材水溶性提取物中的其他組份可直接影響原兒茶醛和丹酚酸B的吸收及消除，分別對(duì)它們產(chǎn)生抑制和促進(jìn)作用。因此，利用中藥中含有的“標(biāo)志成分”的純品（或標(biāo)準(zhǔn)品）進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究是必要的，這也是目前中藥藥動(dòng)學(xué)研究的重要方法，可以提供較好的參考，但卻不能以此代替中藥材提取物或中藥復(fù)方制劑（更復(fù)雜）的藥動(dòng)學(xué)研究。,,22,丹參脂

21、溶性成分的大鼠藥代動(dòng)力學(xué)研究,同時(shí)分析檢測(cè)7個(gè)活性成分，獲得其中5個(gè)成分的大鼠體內(nèi)的經(jīng)時(shí)過程,Mean ratio-time profile of several compounds in Danshen acetic ether extract,23,藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì),Sprague-Dawley大鼠18只，平分為3組，每組雌雄各半，體重250±10g，大鼠于受試的前晚起禁食，不禁水，于給藥4小時(shí)后進(jìn)食。3組大鼠分別灌胃

22、給藥丹參酮ⅡA單體8.0mg·kg-1 隱丹參酮單體5.7mg·kg-1丹參脂溶性提取物（相當(dāng)于分別含隱丹參酮、丹參酮ⅡA為5.7和8.0 mg·kg-1） 分別于給藥后5、10、15、20、30、40min和 1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0h從眼底靜脈叢取血0.5mL，置肝素鈉抗凝處理過的試管中，3000 r·min-1離心10min，轉(zhuǎn)移血漿

23、，置-20℃保存待測(cè)。,24,藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果-1,Mean concentration–time profiles of cryptotanshinone in rat plasma after intra-gavage of cryptotanshinone (5.7 mg/kg) and tanshinones extract (23.3 mg/kg) (mean±S.D., n = 6). The Cmax and AU

24、C were significantly different (P < 0.001).,25,Mean concentration–time profiles of tanshinone IIA in rat plasma after intra-gavage of cryptotanshinone (5.7 mg/kg), tanshinone IIA (8.0 mg/kg) and tanshinones extract (2

25、3.3 mg/kg) (mean±S.D., n = 6).,藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果-2,26,結(jié)果分析與討論,1. 灌胃丹參酮ⅡA 或隱丹參酮單體后丹參酮ⅡA 的藥動(dòng)學(xué)結(jié)果比較： 根據(jù)隱丹參酮的代謝物丹參酮ⅡATmax為25min可以發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮在大鼠體內(nèi)很快就發(fā)生脫氫反應(yīng)被代謝丹參酮ⅡA，灌胃丹參酮ⅡA 8mg/kg時(shí)AUC為499.37ng/ml·min還沒有灌胃隱丹參酮5.7mg/kg時(shí)代謝產(chǎn)生的

26、丹參酮ⅡA的AUC為560.68ng/ml·min高，說明丹參酮ⅡA的口服吸收很不好。 比較灌胃丹參酮ⅡA和灌胃隱丹參酮后丹參酮ⅡA的消除半衰期，經(jīng)方差分析（P=0.46＞0.05）結(jié)果表明兩者無明顯差異。,丹參酮ⅡA 隱丹參酮,27,結(jié)果分析與討論,2. 灌胃隱丹參酮單體或丹參脂溶性提取物后隱丹參酮 的藥動(dòng)學(xué)結(jié)果比較：,灌胃丹參酮提取物后所測(cè)得的隱丹參酮的Cmax和AUC(Tn)分別提高了5.3倍和3.

27、8倍。說明，丹參酮提取物中的其他成份可促進(jìn)藥效成份隱丹參酮的吸收從而對(duì)其藥動(dòng)學(xué)行為產(chǎn)生明顯的影響。 大鼠分別灌胃給予隱丹參酮單體和丹參酮提取物后，隱丹參酮的藥－時(shí)曲線分別符合一、二房室模型，Tmax無差異。說明提取物中的其他成份對(duì)使隱丹參酮在大鼠體內(nèi)的吸收速度加快，同時(shí)使其從中央室向周邊室分布。,28,結(jié)果分析與討論,3. 灌胃丹參酮ⅡA單體或丹參脂溶性提取物后丹參酮ⅡA的藥動(dòng)學(xué)結(jié)果比較：,灌胃丹參酮提取物后所測(cè)得的丹參

28、酮ⅡA的Cmax和AUC(Tn) 分別提高了10.0倍和18.5倍。說明，丹參酮提取物中的其他成份可促進(jìn)藥效成份丹參酮ⅡA的吸收、影響其代謝消除、或存在轉(zhuǎn)化，從而對(duì)其藥動(dòng)學(xué)行為產(chǎn)生明顯的影響。 對(duì)于大鼠分別灌胃給予丹參酮ⅡA、隱丹參酮單體和丹參酮提取物后，丹參酮ⅡA的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較可以發(fā)現(xiàn)，在丹參酮提取物中的其他組份可協(xié)同促進(jìn)丹參酮ⅡA在大鼠體內(nèi)的吸收的同時(shí)，隱丹參酮也脫氫反應(yīng)代謝產(chǎn)生丹參酮ⅡA，兩種作用的加合致使丹參酮

29、提取物組丹參酮ⅡA的AUC為丹參酮ⅡA組的18.5倍，Tmax的顯著性差異也說明這一點(diǎn)，與文獻(xiàn)報(bào)道從十二指腸給藥情況相一致。,29,第一部分 結(jié) 論,丹參提取物比較藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，中藥材中的其他成分對(duì)其“標(biāo)志成分”或“藥效成分”的體內(nèi)過程有較大的影響。拮抗：原兒茶醛；協(xié)同：丹酚酸B、丹參酮ⅡA及隱丹參酮；促進(jìn)轉(zhuǎn)化：隱丹參酮代謝為丹參酮ⅡA。,30,第二部分 復(fù)方中藥藥代動(dòng)力學(xué),有效成份單體與其在中藥提取物

30、中的體內(nèi)過程并不一致，復(fù)方中藥成分更加復(fù)雜，是否也存在相互作用some ingredients in the Huang–Lian–Jie–Du–Tang had pharmacokinetic interaction with baicalin and wogonosideComparative pharmacokinetics of baicalin after oral administration of pure baica

31、lin, Radix Scutellariae extract and Huang–Lian–Jie–Du–Tang to rats. J. Ethnopharmacol. 2007, 110, 412–418.,31,第二部分復(fù)方丹參制劑比較藥代動(dòng)力學(xué),丹參和三七配伍后主要活性成分藥代動(dòng)力學(xué)相互作用，探討它們的配伍機(jī)制,32,復(fù)方丹參方的藥代動(dòng)力學(xué)研究,復(fù)方丹參方由丹參、三七和冰片三味藥材組成。是活血化瘀的名方，廣泛用于治療冠

32、心病、心肌梗塞、心絞痛、抗血栓等心血管疾病。來源于丹參的酚酸類成分和二萜醌類成分及來源于三七的皂苷類成分是復(fù)方丹參方中的主要藥效物質(zhì)。,33,復(fù)方丹參方主要活性成分結(jié)構(gòu),,,,三七皂苷R1,人參皂苷Rg1,人參皂苷Rb1,,,,酚酸類成分,二萜醌類成分,皂苷成分,34,受試灌胃混懸液的制備和含量測(cè)定,,丹參灌胃液：丹參片30片，CMC-Na制備三七灌胃液：三七片20片，同法制備丹參-三七配伍灌胃液：丹參片30片+三

33、七片20片，同法制備,35,藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì),三周期自身對(duì)照試驗(yàn)設(shè)計(jì) 健康比格犬8只，雌雄各半，給藥劑量均為1ml/kg周期1 丹參混懸液：相當(dāng)于丹參素0.21 mg·kg-1，丹參酮ⅡA0.19 mg·kg-1，隱丹參酮0.20 mg·kg-1 周期2 三七混懸液 ：相當(dāng)于三七皂苷R10.46 mg·kg-1，人參皂苷Rg11.75 mg·kg-1和人參皂苷Rb12.02 mg

34、·kg-1周期3 丹參-三七配伍混懸液 灌服前及灌服后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、12、24、48、72、96和120 h分別經(jīng)前肢靜脈取血約3.5mL，置肝素化離心管中，900?g離心10 min分取血漿，于-80℃避光保存供血藥濃度測(cè)定用。 比格犬經(jīng)過足夠長(zhǎng)的清洗期后開始下一周期試驗(yàn)。,36,血藥濃度測(cè)定結(jié)果,配伍前后藥動(dòng)學(xué)行為有顯著差異：丹參素、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、

35、人參皂苷Rb1,37,血藥濃度測(cè)定結(jié)果,配伍前后藥動(dòng)學(xué)行為無顯著差異：丹參酮ⅡA 、隱丹參酮,38,小結(jié)與討論,藥動(dòng)與藥效：配伍對(duì)于丹參素和三個(gè)皂苷成分的藥代動(dòng)力學(xué)行為有較大影響。但這并不一定意味著中藥配伍后整體藥效的下降。丹參、三七配伍作為經(jīng)典的藥對(duì)，其活血化瘀的療效優(yōu)于單味藥已久經(jīng)考驗(yàn)。文獻(xiàn)報(bào)道，人參皂苷Rb1對(duì)于心肌細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的活性在5nmol時(shí)出現(xiàn)最大值；人參皂苷Rg1和Rb1均在濃度為40 µg·mL

36、-1時(shí)有最強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用，而在更高劑量時(shí)無作用甚至出現(xiàn)反作用 腸道菌群作用：皂苷成分口服進(jìn)入體內(nèi)后，大部分在腸道菌群的作用下水解生成其代謝產(chǎn)物，僅有小部分能進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)。,39,Publications,Min Song, Tai-jun Hang, Zhengxing Zhang, Hong-Yuan Chen. Effects of the coexsting diterpenoid tanshinones on the pha

37、rmacokinetics of cryptotanshinone and tanshinone ⅡA in rat. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2007(32): 247-253. (IF 3.127）宋敏，杭太俊，張正行. 隱丹參酮及丹參酮提取物在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)比較研究。中國(guó)藥學(xué)雜志，2008，43（1）：51～54Min Song, Tai-jun Hang, Z

38、heng-xing Zhang, et al. Determination of cryptotanshinone and its metabolite in rat plasma by liquid chromatography–tandem mass spectrometry [J]. Journal of Chromatography B. 2005, 827: 205~209 (IF 2.77)宋敏，杭太俊，張正行. 丹參提取

39、物有效成分在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和相互影響研究。藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42（3）：301～307張絲韻，宋敏，盧俊剛，杭太俊.丹參與三七配伍對(duì)主要活性成分藥代動(dòng)力學(xué)行為的影響。藥學(xué)學(xué)報(bào)，in print.Min Song, Siyun Zhang, Xiaoyan Xu, Taijun Hang, Lee Jia. Simultaneous determination by LC-MS/MS of three Panax notogi