致病性霍亂弧菌特異性基因序列三重TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR快速檢測(cè)體系的建立.pdf

1、目的：建立針對(duì)產(chǎn)毒性01群及0139群霍亂弧菌的高敏感、高特異的實(shí)時(shí)熒光三重TaqMan聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)快速檢測(cè)體系。探討該體系對(duì)臨床模擬標(biāo)本檢測(cè)的意義，為該體系的臨床應(yīng)用提供可靠的技術(shù)依據(jù)。 方法：根據(jù)01群霍亂弧菌主基因組O抗原編碼基因rfb-01、0139群霍亂弧菌主基因組0抗原編碼基因rfb-0139和霍亂腸毒素的A亞基編碼基因ctxA的特異性序列設(shè)計(jì)引物及TaqMan探針，構(gòu)建各個(gè)目的靶序列的重組質(zhì)粒，制備濃度為1.0×

2、1010～1.0×10-1拷貝/ul的質(zhì)粒梯度稀釋模板，并將01群和0139群霍亂弧菌基因組DNA分別梯度稀釋至1×105 pg到1×10-3 pg，利用便攜式Smart cyclerⅡ?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)平臺(tái)探討該檢測(cè)體系的敏感性，用19種其他腸道致病菌及院內(nèi)感染常見致病菌評(píng)價(jià)該檢測(cè)體系的特異性。將01群霍亂弧菌滅活菌株懸液[1.0×1011 CFU(菌落形成單位)/ml]連續(xù)10倍稀釋后與健康成人新鮮糞便混勻，制備成5.0×101～5

3、.0×109 CFU/g梯度濃度的模擬帶菌者糞便標(biāo)本，將0139群霍亂弧菌滅活菌株懸液[1.0×1010CFU<菌落形成單位)/ml]連續(xù)10倍稀釋后與健康成人新鮮糞便混勻，制備成5.0×101～5.0×108 CFU/g梯度濃度的模擬帶菌者糞便標(biāo)本，提取DNA，用以評(píng)價(jià)產(chǎn)毒型01群及0139群霍亂弧菌實(shí)時(shí)熒光雙重TaqMan PCR法對(duì)臨床模擬標(biāo)本檢測(cè)的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。 結(jié)果：實(shí)時(shí)熒光三重TaqMan聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)快速

4、檢測(cè)體系對(duì)重組質(zhì)粒的檢測(cè)敏感度為1.0×102拷貝每反應(yīng)體系；對(duì)01群霍亂弧菌基因組DNA的檢測(cè)敏感度為1.0×10-1pg每反應(yīng)體系；對(duì)0139群霍亂弧菌基因組DNA的檢測(cè)敏感度為1.0×10-1pg每反應(yīng)體系；該實(shí)時(shí)熒光三重TaqMan聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測(cè)體系對(duì)01群霍亂弧菌或0139群霍亂弧菌的模擬帶菌者糞便標(biāo)本的檢測(cè)敏感度均為1.0×103CFU每反應(yīng)體系，亦相當(dāng)于模擬帶菌者糞便標(biāo)本5.0×104 CFU/g；對(duì)不同含菌量的模擬

5、帶菌者糞便標(biāo)本的三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各靶序列擴(kuò)增反應(yīng)CT值的檢測(cè)變異系數(shù)均小于5％；對(duì)新鮮健康成人糞便標(biāo)本的檢測(cè)未見明確的異常擴(kuò)增。該檢測(cè)體系在檢測(cè)19種與霍亂弧菌具有相同生活環(huán)境的細(xì)菌時(shí)不存在非特異性擴(kuò)增；在特異性評(píng)價(jià)中，3名健康成人新鮮糞便標(biāo)本的陰性對(duì)照均未見異常擴(kuò)增曲線。整個(gè)反應(yīng)在3個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。 結(jié)論：該研究建立的實(shí)時(shí)熒光三重TaqMan聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)體系可作為糞便中01群或0139群霍亂弧菌特異、敏感、快速的檢測(cè)