利用大鼠Y染色體特異性PCR技術(shù)檢測卵圓細(xì)胞源性肝癌細(xì)胞.pdf

1、一、研究背景 卵圓細(xì)胞(ovalcell，OVC)是存在肝臟組織中的能自我復(fù)制并具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，它既可以長期增殖，又可以分化為成熟肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞。OVC在肝細(xì)胞發(fā)育、生長、增生及癌變等生理和病理生理過程中起著重要作用。正常情況下肝臟細(xì)胞處于靜止期，分裂增殖緩慢，卵圓細(xì)胞極少被檢測到。當(dāng)肝臟受到嚴(yán)重?fù)p傷或肝細(xì)胞的增殖受到抑制時，卵圓細(xì)胞被激活，增殖，分化形成成熟肝細(xì)胞。肝臟嚴(yán)重?fù)p傷時，卵圓細(xì)胞受自身狀態(tài)和微環(huán)境的調(diào)

2、節(jié)，分化為成熟肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，但其分化方向并不是固定不變，有研究表明，卵圓細(xì)胞在特定的自身狀態(tài)和微環(huán)境的調(diào)節(jié)下，可以分化為肝癌細(xì)胞。另有研究發(fā)現(xiàn)，肝損傷時，OVC不僅出現(xiàn)在匯管區(qū)，而且還存在于肝小葉內(nèi)。OVC其特點(diǎn)是細(xì)胞小，呈卵圓型，核大而胞漿少。研究發(fā)現(xiàn)OVC與原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)關(guān)系密切。以3'-甲基-4-二甲基偶氮苯(3'-methyl-dimethylaminoazobenz

3、ene，DAB)為誘導(dǎo)劑，建立大鼠肝臟OVC增殖模型，密度梯度離心法分離OVC，在此基礎(chǔ)上，我們采用光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡和免疫組化方法鑒定OVC。利用Y染色體體細(xì)胞的特異性PCR檢測技術(shù)來尋找卵圓細(xì)胞在體內(nèi)分化為肝癌細(xì)胞的直接證據(jù)。把分離出來的雄性大鼠肝卵圓細(xì)胞接種于雌性大鼠肝內(nèi)，然后對雌性大鼠進(jìn)行致癌劑誘導(dǎo)，在雌性大鼠的肝癌組織中利用PCR檢測技術(shù)分析肝癌細(xì)胞的來源。 二、目的 建立大鼠肝卵圓細(xì)胞的增殖模型，并探索其

4、分離及鑒定的方法，對研究肝癌的組織起源具有重要意義。利用Y染色體體細(xì)胞的特異性來尋找卵圓細(xì)胞分化為肝癌細(xì)胞的直接證據(jù)，從而為卵圓細(xì)胞源性的研究及臨床肝癌治療方法提供理論依據(jù)。 三、方法 1.采用DAB飼喂大鼠，誘導(dǎo)建立肝癌動物模型，結(jié)果顯示DAB是一種簡單經(jīng)濟(jì)有效的肝癌誘導(dǎo)劑。 2.采用Ⅳ型膠原酶分次靜脈灌注和改良密度梯度離心法分離肝臟卵圓細(xì)胞，分離成功后，用F12和DMEM(1∶1)培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色細(xì)

5、胞活力達(dá)95％，接種于塑料培養(yǎng)瓶于孵箱中培養(yǎng)。通過HE染色、免疫組組織化學(xué)SABC法及透射電鏡的方法進(jìn)行卵圓細(xì)胞的鑒定。結(jié)果顯示該方法能成功獲得高密度的細(xì)胞，所分離的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)以及同時表達(dá)c-kit抗體、CD34抗體、波形蛋白抗體，符合卵圓細(xì)胞特點(diǎn)。 3.選擇健康雄性Wistar大鼠30只用于卵圓細(xì)胞的分離、提取和鑒定。飼喂每公斤含0.6克3'-甲基-4-二甲基偶氮苯的飼料(以下簡稱含DAB飼料)4wk，建立卵圓細(xì)胞增生的雄

6、性Wistar大鼠動物模型，提取雄性大鼠卵圓細(xì)胞備用。選擇雌性Wistar大鼠60只隨機(jī)平分成實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組按25mg/kg體重戊巴比妥腹腔麻醉，消毒開腹，用4[＃]針頭吸取雄性Wistar大鼠卵圓細(xì)胞懸液，接種至雌性大鼠肝臟包膜下，每點(diǎn)106個，之后連續(xù)喂含DAB飼料14wk，促進(jìn)肝腫瘤的生成。對照組不接種提取的雄性Wistar大鼠卵圓細(xì)胞懸液，連續(xù)喂含DAB飼料14wk。從GeneBank調(diào)出雄性大鼠的SRY基因，利用引物設(shè)

7、計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物片斷。14wk后提取兩組大鼠肝腫瘤組織的基因組DNA，利用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。 四、結(jié)果 1.通過鑒定得出提取的細(xì)胞為卵圓細(xì)胞，細(xì)胞多出現(xiàn)于匯管區(qū)膽管上皮層及中央靜脈周圍，細(xì)胞呈現(xiàn)嗜堿性，體積約為正常肝細(xì)胞的1/3。電鏡下觀察卵圓細(xì)胞核/漿比例大，細(xì)胞表面可見絨毛狀突起等特征。免疫組織化學(xué)檢測呈現(xiàn)棕黃色陽性結(jié)果。所分離的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)以及同時表達(dá)C-kit抗體、CD34抗體