全反式維甲酸對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468,MCF-7增殖和凋亡及BP1表達(dá)影響的研究.pdf

1、乳腺癌已成為當(dāng)代女性腫瘤性疾病中發(fā)病率最高的腫瘤,嚴(yán)重威脅著女性的健康甚至生命。盡管手術(shù)、化療和放療手段有了長足的進(jìn)步,大多數(shù)的患者仍然最終出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移,致使治療失敗。
　　 腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化和促分化治療作為腫瘤治療的一條新的抗腫瘤途徑,近年以此為中心的研究非?；钴S。維甲酸類化合物可將具有無限增殖潛能的惡性細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為具有正常分化功能的細(xì)胞,是近年來腫瘤治療的熱點(diǎn)之一。維甲酸類化合物作為確切的誘導(dǎo)分化劑,其在白血病方面的臨床應(yīng)

2、用,療效己是十分確切。但在實(shí)體腫瘤包括乳腺癌的研究報(bào)道很少。因此尋找體外高效、低毒的誘導(dǎo)分化劑勢(shì)在必行。
　　 本研究應(yīng)用全反式維甲酸作用于不同雌激素受體類型的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468及MCF-7,運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、免疫化學(xué)技術(shù)、TUNEL、PCR等分子生物學(xué)技術(shù),觀察比較兩種人乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期分布的改變,并檢測BP1基因及凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中蛋白的表達(dá),探討其發(fā)生機(jī)制,為藥物治療乳腺癌開拓新的思

3、路。本研究分為以下三部分:
　　 第一部分全反式維甲酸對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468,MCF-7增殖抑制,誘導(dǎo)凋亡和周期阻滯的研究
　　 目的
　　 研究全反式維甲酸(ATRA)對(duì)體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468、MCF-7增殖、凋亡和周期分布的影響
　　 材料和方法：
　　 將體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞隨機(jī)分為6組:空白對(duì)照組；10-3mol/LATRA組；10-4mol/L,ATRA

4、組；10-5mol/LATRA組；10-6mol/L ATRA組；10-7mol/L ATRA組。加入藥物進(jìn)行干預(yù)后,分別于24h、48h、72h、96h、120h及144h收集各組細(xì)胞。應(yīng)用MTT比色法繪制細(xì)胞生長曲線及計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率；TUNEL法、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期分布情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.ATRA作用兩種人乳腺癌細(xì)胞后其增殖活性受到明顯抑制,在不同濃度組間,不同時(shí)間組間比較,增值抑制率均

5、存在差異,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).存在時(shí)間依賴性及濃度依賴性。同對(duì)照組相比,經(jīng)過不同濃度ATRA作用后,各實(shí)驗(yàn)組乳腺癌細(xì)胞均表現(xiàn)為生長速度減緩,抑制率增強(qiáng),其抑制率同物濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系。在相同ATRA濃度及相同作用時(shí)間下ER陰性表達(dá)(ER-)細(xì)胞系MDA-MB-468抑制率較ER陽性表達(dá)(ER+)細(xì)胞MCF-7高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2.光學(xué)顯微鏡下,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)發(fā)生改變,隨藥物

6、濃度及作用時(shí)間延長而更為顯著.
　　 3.TUNEL檢測結(jié)果顯示,人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468及MCF-7凋亡指數(shù)隨藥物作用時(shí)間延長而增加,在72h可達(dá)(32.93±1.512)％、(12.38±1.728)％,與未處理組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),MDA-MB-468細(xì)胞顯著高于MCF-7細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,ATRA干預(yù)兩種人乳腺癌細(xì)胞后,其細(xì)胞周期和

7、凋亡率均發(fā)生改變:與對(duì)照組相比,10-5mol/LATRA干預(yù)后,G0/G1期細(xì)胞比例逐漸增加,而G2/M、s期細(xì)胞比例相應(yīng)減少；同時(shí),細(xì)胞凋亡率也逐漸升高,作用72h后,早期凋亡率可達(dá)(11.53±1.618)％、(6.22±0.731)％,較對(duì)照組均有升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；G0/G1期比例和凋亡率的增加與藥物作用時(shí)間呈正向變化關(guān)系。ER(-)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468凋亡率升高更為顯著。
　　 結(jié)論：<

8、br>　　 1.ATRA可以抑制體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞的增殖,呈時(shí)間及劑量依賴性。
　　 2.ATRA通過阻滯人乳腺癌細(xì)胞生長周期于G0/G1期,并誘發(fā)其凋亡而抑制細(xì)胞生長,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化,降低其侵襲性,存在時(shí)間依賴性。在一定的藥物濃度范圍內(nèi),增加藥物濃度或延長作用時(shí)間可增強(qiáng)藥物腫瘤抑制效應(yīng)。ATRA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在ER(-)人乳腺癌細(xì)胞中更為顯著。
　　 3.ATRA可做為治療乳腺癌的抗腫瘤藥物。
　　 第

9、二部分全反式維甲酸對(duì)人乳腺癌細(xì)胞中BP1、Survivin及stat3表達(dá)影響的研究
　　 目的
　　 研究體ATRA作用外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468及MCF-7后BP1基因mRNA及其蛋白表達(dá)的影響,同時(shí)平行檢測凋亡相關(guān)蛋白Survivin及Stat3表達(dá)水平的變化,探討ATRA抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　 材料和方法：
　　 同前進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),應(yīng)用篩選出的藥物濃度進(jìn)行藥物干預(yù),

10、分別于培養(yǎng)24h、48h和72h后,應(yīng)用RT-PCR法半定量檢測BP1mRNA表達(dá)水平改變,并應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測BP1、Survivin及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Stat3蛋白的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.人乳腺癌細(xì)胞中MDA-MB-468及MCF-7中BP1mRNA表達(dá)水平存在差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)ATRA作用后人乳腺癌細(xì)胞BP1mRNA表達(dá)水平下降,于對(duì)照組相比,各時(shí)間組細(xì)胞BP1mRNA電泳條帶光

11、密度比率(ODR)值逐漸降低。ATRA作用24h,48h,72h后,BP1mRNA表達(dá)水平呈下降趨勢(shì),各時(shí)間組間存在顯著性差異(P<0.05),ODR值同作用時(shí)間成負(fù)相關(guān)。ER(-)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468中BP1mRNA表達(dá)下調(diào)更為明顯。
　　 2.在MDA-MB-468及MCF-7細(xì)胞中,ATRA作用后Survivin及Stat3mRNA表達(dá)均下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.經(jīng)ATRA作用

12、后人乳腺癌細(xì)胞BP1、Survivin及Stat3蛋白的表達(dá)均呈下降趨勢(shì)；同對(duì)照組相比,經(jīng)10-5mmol/LATRA作用24h、48h及72h后,BP1蛋白表達(dá)水平均有顯著下降(P<0.05)；同ER(+)乳腺癌細(xì)胞系相比,ER(-)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468中下調(diào)更為明顯。
　　 4.ATRA可抑制人乳腺癌細(xì)胞系中BP1、Survivin和Stat3 mRNA及蛋白表達(dá),三者下調(diào)具有同步性。
　　 結(jié)論：

13、>　　 1.人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468及MCF-7中BP1基因表達(dá)下調(diào),可能參與了ATRA抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的過程。在一定范圍內(nèi),增加藥物濃度或延長藥物作用時(shí)間可增強(qiáng)此效應(yīng)。
　　 2.Survivin及Stat3參與了ATRA對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制及促凋亡作用；
　　 3.ATRA可能通過Survivin、Stat3通路調(diào)控BP1基因表達(dá)；
　　 4.BP1基因及蛋白可以做為原癌基因進(jìn)行更為深入

14、的研究,同時(shí)可作為乳腺癌治療的靶點(diǎn)。
　　 第三部分BP1、C-erbB-2在乳腺癌組織中表達(dá)及其在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究
　　 目的
　　 檢測乳腺癌組織,配對(duì)癌旁和正常乳腺組織中BP1,C-erbB-2的蛋白水平表達(dá)規(guī)律,探討其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的意義,更好的明確乳腺癌的發(fā)病機(jī)制,為乳腺癌的早期診斷,治療及預(yù)后提供更多的分子指標(biāo)。
　　 材料和方法：
　　 運(yùn)用RT-PCR.

15、技術(shù)檢測74乳腺癌組織、配對(duì)癌旁和正常乳腺組織中BP1mRNA的表達(dá)差異及相關(guān),并運(yùn)用雙重免疫組織化學(xué)化技術(shù)檢測BP1、C-erbB-2蛋白的表達(dá)情況。分析兩者同乳腺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系,并探討兩個(gè)指標(biāo)之間的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1.RT-PCR結(jié)果顯示:74例乳腺癌、配對(duì)癌旁及正常組織中BP1 mRNA陽性表達(dá)率分別為64.8％(48/74)、8.1％(6/74)和1.3％(1/74)。乳腺癌標(biāo)本中BP1mRN

16、A陽性表達(dá)率顯著高于癌旁及正常乳腺組織(P<0.05)。BP1的表達(dá)與腫瘤臨床分期、病理學(xué)分級(jí)、雌激素受體等臨床病理學(xué)參數(shù)之間存在顯著的相關(guān)性。雌激素受體陰性的乳腺癌組織中,BP1的陽性表達(dá)率92.3％(24/26)顯著高于雌激素受體陽性的乳腺癌組織47.9％(23/48)(P<0.05),且BP1的表達(dá)水平隨腫瘤臨床分期的升高而升高,雙重免疫組化檢測BP1蛋白結(jié)果和PCR結(jié)果吻合,呈現(xiàn)一致的變化趨勢(shì)。
　　 2.乳腺癌中C-e

17、rbB-2蛋白陽性表達(dá)率是48.6％(36/74),顯著高于配對(duì)癌旁及正常乳腺組織(P<0.05)。C-erbB-2蛋白表達(dá)率在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,臨床分期Ⅲ期組顯著高于Ⅰ、Ⅱ期組(P<0.05)。浸潤性癌組織中顯著高于原位癌組及正常乳腺組織。
　　 3.相關(guān)性分析顯示:BP1與C-erbB-2蛋白陽性表達(dá)率之間均存在顯著關(guān)聯(lián)(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.BP1基因表達(dá)水平與乳腺癌的

18、發(fā)生密切相關(guān),且與腫瘤臨床分期、病理學(xué)分級(jí)、雌激素受體等臨床病理學(xué)參數(shù)之間存在顯著的相關(guān)性。雙重免疫組化技術(shù)檢測乳腺癌組織BP1蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果和RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致,
　　 2.C-erbB-2蛋白陽性表達(dá)與乳腺癌臨床分期、病理學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,提示C-erbB-2蛋白的表達(dá)水平與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)。
　　 3.BP1與C-erbB-2蛋白陽性表達(dá)率之間存在顯著性關(guān)聯(lián),提示可能通過C-erb