人Bmi-1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定及其對(duì)乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞的效應(yīng).pdf

1、背景和目的
　　 乳腺癌是嚴(yán)重危害婦女健康的一種疾病。Bmi-1基因(B-cell specificmoloney leukemia virus insert site l,Bmi-1)是PcG(polycomb group genes)家族重要的調(diào)節(jié)基因,位于人類10號(hào)染色體短臂1區(qū)3帶(10p13),在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及增殖方面具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),Bmi-1基因在乳腺癌及乳腺癌細(xì)胞系中高表達(dá),與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但其

2、作用機(jī)制仍不清楚。
　　 研究顯示,在人正常鼻咽上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Bmi-1基因后,能夠激活hTERT的轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)端粒酶活性并維持端粒在一定的長(zhǎng)度,并且能夠下調(diào)p16INK4a的表達(dá),影響細(xì)胞周期及增殖,促使人正常鼻咽上皮永生化。此外,Bmi-1基因可以維持胚胎干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的自我更新及增殖活性,目前已有研究證明,在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)Bmi-1基因后,能夠上調(diào)Oct-4的表達(dá),提示Bmi-1基因可能在干細(xì)胞水平參

3、與了神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展。
　　 在以往研究的基礎(chǔ)上,本研究構(gòu)建人Bmi-1基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-Bmi-1。轉(zhuǎn)染人乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞48h后,RT-PCR鑒定目的基因Bmi-1的mRNA表達(dá)變化,以G418進(jìn)行篩選,建立了pcDNA3.1(+)-Bmi-1真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的乳腺癌細(xì)胞系。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法驗(yàn)證Bmi-1基因蛋白水平上的表達(dá)變化。應(yīng)用RT-PCR的方法檢測(cè)Bmi-1基因mR

4、NA水平上的表達(dá)變化。通過(guò)MTT技術(shù)檢測(cè)pcDNA3.1(+)-Bmi-1表達(dá)載體對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞的影響,為進(jìn)一步深入探討B(tài)mi-1基因在乳腺癌中發(fā)生作用的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 材料與方法
　　 1.主要材料:人乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞由鄭州大學(xué)中英醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)由鄭州大學(xué)生化教研室臧明璽教授及鄭州大學(xué)組胚教研室楊繼要老師惠贈(zèng)。
　　 2.構(gòu)建pcDNA

5、3.1(+)-Bmi-1真核表達(dá)載體:采用半定量RT-PCR的方法檢測(cè)乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞及MCF-7細(xì)胞中Bmi-1mRNA的表達(dá)。從MCF-7細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR擴(kuò)增Bmi-1 cDNA全長(zhǎng)。將Bmi-1基因片段經(jīng)T-A克隆后亞克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+),構(gòu)建成人Bmi-1基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-Bmi-1,酶切、電泳及測(cè)序鑒定。
　　 3.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

6、:乳腺癌MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含有10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中,37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)；乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞于含有10％FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中,37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染MDA-MB-468細(xì)胞前,更換新鮮培養(yǎng)基。采用高純度中量質(zhì)粒提取試劑盒抽提pcDNA3.1(+)與pcDNA3.1(+)-Bmi-1。MDA-MB-468細(xì)胞隨機(jī)分為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組,空載體組和空白對(duì)照組,用Lipofe

7、cter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將pcDNA3.1(+)-Bmi-1導(dǎo)入重組載體轉(zhuǎn)染組,將。pcDNA3.1(+)導(dǎo)入空載體組,空白對(duì)照組未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。
　　 4.篩選與擴(kuò)增:轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板后,按1:4的密度比傳代至新的培養(yǎng)板。于含有1mg/mlG418的DMEM高糖選擇性培養(yǎng)基中篩選,每3d更換一次培養(yǎng)基,至第7天,空白對(duì)照組細(xì)胞死亡,改用400μg/ml的選擇性培養(yǎng)基繼續(xù)篩選,約2w后,陽(yáng)性細(xì)胞克隆形成,將單克隆細(xì)胞挑入24孔板

8、,繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板后,移入培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)。
　　 5.pcDNA3.1(+)-Bmi-1表達(dá)載體對(duì)乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞的效應(yīng):應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)Bmi-1、hTERT、p16INK4a及Oct-4蛋白表達(dá)水平的變化；應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)Bmi-1及hTERT的mRNA表達(dá)水平變化;應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況的改變。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,數(shù)值用(X)

9、±S表示。采用單因素方差分析進(jìn)行組見差異比較,以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-Bmi-1的構(gòu)建:Bmi-1 mRNA在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)較高,而在MDA-MB-468細(xì)胞中僅適量表達(dá)；從MCF-7細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR擴(kuò)增Bmi-1 cDNA全長(zhǎng),并通過(guò)膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化；T-A克隆后,行菌液PCR、酶切圖譜驗(yàn)證重組陽(yáng)性

10、克??；對(duì)pcDNA3.1(+)-Bmi-1進(jìn)行酶切和序列分析,酶切圖譜及插入序列與預(yù)期結(jié)果一致。
　　 2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MDA-MB-468細(xì)胞:3組細(xì)胞中Bmi-1及hTERT的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為:重組載體轉(zhuǎn)染組,0.943±0.095和0.396±0.015。空載體組,0.603±0.015和0.244±0.007?？瞻讓?duì)照組,0.600±0.014和0.240±0.006。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Bmi-1及hTERT的mRNA表

11、達(dá)水平高于空載體組和空白對(duì)照組(P<0.05)。
　　 3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后Bmi-1及hTERT的表達(dá):3組細(xì)胞中Bmi-1和hTERT的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為:重組載體轉(zhuǎn)染組,8.77±1.12和6.59±0.40。空載體組,6.05±0.43和4.66±0.39。空白對(duì)照組,6.07±0.35和4.17±0.58。3組細(xì)胞中Bmi-1和hTERT的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為:重組載體轉(zhuǎn)染組,1.001±0.040和0.402±0.0

12、18。空載體組,0.628±0.034和0.263±0.022?？瞻讓?duì)照組,0.600±0.033和0.266±0.321。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Bmi-1、hTERT的表達(dá)水平高于空載體轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組(P<0.05)。
　　 4.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后p16INK4a及Oct-4的蛋白表達(dá):3組細(xì)胞中p16INK4a和Oct-4的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為:重組載體轉(zhuǎn)染組,2.90±0.33和4.09±0.14?？蛰d體組,5.28±0.34和2.1

13、4±0.19?？瞻讓?duì)照組,4.96±0.37和2.18±0.15。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組p16INK4a蛋白表達(dá)水平低于空載體組和空白對(duì)照組(P<0.05),而重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Oct-4的蛋白表達(dá)水平高于空載體組和空白對(duì)照組(P<0.05)。
　　 5.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后MTT結(jié)果:3組細(xì)胞吸光值分別為:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組,0.718±0.015?？蛰d體組,0.481±0.009?？瞻讓?duì)照組,0.506±0.010。與其它兩組相比,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞

14、增殖能力顯著增強(qiáng)(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.構(gòu)建了人Bmi-1基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-Bmi-1.
　　 2.建立了穩(wěn)定高表達(dá)Bmi-1的乳腺癌細(xì)胞系。
　　 3.真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-Bmi-1轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞后,Bmi-1表達(dá)活性增高,并且其過(guò)表達(dá)可上調(diào)hTERT及Oct-4的表達(dá),下調(diào)p16INK4a的表達(dá),并有效增強(qiáng)乳腺癌MDA-M