磷酸肌酸鈉對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的體外作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：心臟毒性是抗腫瘤藥物常見(jiàn)的不良反應(yīng)之一，尤其是蒽環(huán)類抗腫瘤藥物最為明顯。磷酸肌酸鈉（Creatine Phosphate Sodium，CP）作為一種高能磷酸化合物，不僅可以在心肌細(xì)胞遭受缺血缺氧時(shí)為其提供能量，還可以保護(hù)心肌細(xì)胞膜免受氧自由基等有害物質(zhì)的侵襲。作為心肌保護(hù)劑已被廣泛應(yīng)用于心臟內(nèi)外科臨床。有學(xué)者認(rèn)為腫瘤細(xì)胞是高耗能細(xì)胞，應(yīng)用磷酸肌酸可能會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。本研究通過(guò)體外試驗(yàn)探討磷酸肌酸鈉對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3增殖

2、的影響，并對(duì)可能存在的機(jī)制進(jìn)行初步的探討，從而為腫瘤患者是否能夠應(yīng)用磷酸肌酸來(lái)保護(hù)心臟提供參考依據(jù)。
　　 方法：1選取人卵巢癌SKOV3細(xì)胞系進(jìn)行體外培養(yǎng)，采用四甲基偶氮唑藍(lán)（tetrzolium-based colorimetric assaly，MTT）法檢測(cè)磷酸肌酸鈉不同濃度組（1、6、12mmol/L）、不同時(shí)間組（24、48、72h）對(duì)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的影響情況。2流式細(xì)胞儀（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)

3、磷酸肌酸鈉對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞周期分布和凋亡的影響。3根據(jù)MTT的結(jié)果，設(shè)置對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，分別提取各組細(xì)胞總RNA，鑒定其完整性及含量，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（revers transcription.PCR，RT-PCR）半定量檢測(cè)磷酸肌酸鈉處理前后SKOV3細(xì)胞中CyclinDlmRNA、Bcl-2mRNA的表達(dá)水平。4采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)磷酸肌酸鈉處理前后SKOV3細(xì)胞中CyclinD1、Bcl-2蛋白的表達(dá)變化。
　

4、　 結(jié)果：1 MTT結(jié)果顯示：磷酸肌酸鈉（1、6、12mmol/L）對(duì)SKOV3細(xì)胞具有抑制增殖的作用。磷酸肌酸鈉1 mmol/L組處理SKOV3細(xì)胞24、48、72h后，與對(duì)照組相比，OD值有所下降，但差異無(wú)顯著性（P>0.05）。磷酸肌酸鈉6、12mmol/L組處理SKOV3細(xì)胞24、48、72h后，與對(duì)照組相比，OD值均有不同程度的下降，差異具有顯著性（P<0.05）。隨著磷酸肌酸鈉處理濃度的增大、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率逐漸升高

5、，即磷酸肌酸鈉對(duì)SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用呈劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系。以磷酸肌酸鈉12mmol/L組處理SKOV3細(xì)胞72h的增殖抑制作用最明顯。2流式細(xì)胞儀檢測(cè)SKOV3細(xì)胞凋亡和周期分布顯示，1、6、12mmol/L磷酸肌酸鈉作用SKOV3細(xì)胞72h后，隨藥物濃度增大，G0/G1期細(xì)胞逐漸增多，S期細(xì)胞逐漸減少。即磷酸肌酸鈉可阻滯SKOV3細(xì)胞周期進(jìn)程于G0/G1期，該作用呈劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。1、6、12mmol/L磷酸肌

6、酸鈉作用SKOV3細(xì)胞72h后，未出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰，凋亡百分率與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性（P>0.05）。3 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：磷酸肌酸鈉不同濃度組處理SKOV3細(xì)胞72h后，CyclinD1mRNA有不同程度的降低。磷酸肌酸鈉1mmol/L組處理SKOV3細(xì)胞72h后，CyclinD1mRNA表達(dá)有所降低，但與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性（P>O.05）。磷酸肌酸鈉6、12 mmol/L組處理SKOV3細(xì)胞72h后，Cycli

7、nD1mRNA表達(dá)降低，與對(duì)照組比較差異具有顯著性（P<0.05）。以磷酸肌酸鈉12mmol/L組作用72h對(duì)SKOV3細(xì)胞CyclinD1mRNA表達(dá)抑制最顯著。磷酸肌酸鈉1、6、12 mmol/L組處理SKOV3細(xì)胞72h后，Bcl-2mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性（P>0.05）。4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示：0、1、6、12mmol/L磷酸肌酸鈉處理SKOV3細(xì)胞72h后，SKOV3

8、細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)熒光指數(shù)（FI值）分別為1、0.988、0.863、0.718，Bcl-2蛋白表達(dá)熒光指數(shù)（FI值）分別為1、0.977、0.947、0.912。對(duì)于CyclinD1蛋白，磷酸肌酸鈉1mmol/L組與對(duì)照組的FI值相比，差異不具有顯著性（P>0.05）；磷酸肌酸鈉6、12mmol/L組與對(duì)照組的FI值相比，差異具有顯著性（P<0.05）。以磷酸肌酸鈉12mmol/L組作用72h對(duì)SKOV3細(xì)胞CyclinD

9、1蛋白表達(dá)抑制最顯著，與RT-PCR結(jié)果一致。對(duì)于Bcl-2蛋白，磷酸肌酸鈉1、6、12mmol/L組與對(duì)照組的FI值相比，差異無(wú)顯著性（P>0.05），與RT-PCR結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：
　　 1本實(shí)驗(yàn)證實(shí)一定濃度范圍內(nèi)，磷酸肌酸鈉能夠抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖。
　　 2磷酸肌酸鈉作用于人卵巢癌SKOV3細(xì)胞后未見(jiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，Bcl-2表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平未見(jiàn)明顯變化。
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