生物人工肝用人胎肝細(xì)胞的規(guī)?；瘍龃嫜芯?pdf

1、背景：由于肝移植受到供體來源困難，手術(shù)操作復(fù)雜等原因限制，終末期肝病患者常需要生物人工肝(bioartificialliver,BAL)來維持生命。肝細(xì)胞是BAL的主要生物成分，在BAL中起核心作用，其支持作用主要來源于肝細(xì)胞的生物代謝功能。目前肝細(xì)胞來源有異種動(dòng)物肝細(xì)胞、肝干細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞、永生化肝細(xì)胞株、人肝細(xì)胞。其中動(dòng)物來源細(xì)胞有病毒感染的危險(xiǎn)；肝干細(xì)胞還處于研究起步階段，目前用于BAL的條件尚未成熟；轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞制備技術(shù)要求

2、高，尋找合適的基因的問題還未解決。而人肝細(xì)胞安全性好，細(xì)胞生物學(xué)功能相同，能提供同源生物活性物質(zhì)，如白蛋白、肝細(xì)胞再生因子、凝血因子等，并且胎肝細(xì)胞還具有在體外繼續(xù)分化增殖和免疫原性弱的優(yōu)點(diǎn)。上述優(yōu)點(diǎn)是其他細(xì)胞材料不具備的，故為目前生物人工肝的理想細(xì)胞材料。制備一個(gè)具有相似功能的生物人工肝約需要200g肝細(xì)胞。臨床使用的生物反應(yīng)器內(nèi)，細(xì)胞數(shù)量至少應(yīng)該達(dá)到15％的入肝細(xì)胞數(shù)量，即約109個(gè)數(shù)量級(jí)方具有臨床意義。但是肝細(xì)胞的來源受到一定限制

3、，因?yàn)榇蟛糠指闻K用于肝移植，同時(shí)胎肝也不能長期保存，來源和數(shù)量的限制使其應(yīng)用于生物人工肝受到制約。解決大量肝細(xì)胞需求問題傳統(tǒng)上采取傳代培養(yǎng)及用特殊材料為載體進(jìn)行高密度培養(yǎng)方法，但其工作量大、易污染、費(fèi)用高、對(duì)環(huán)境要求高，而且肝細(xì)胞經(jīng)多次傳代后，其活性、功能降低。如將肝細(xì)胞大量凍存建立肝細(xì)胞庫，可以克服以上肝細(xì)胞培養(yǎng)中的各種缺點(diǎn)，是解決大量肝細(xì)胞來源的重要方法。對(duì)凍存而言，凍存保護(hù)劑對(duì)復(fù)蘇后的存活率起著很重要的作用，我們的前期研究，將苦參

4、堿用于胎肝細(xì)胞和肝細(xì)胞低數(shù)量級(jí)的凍存上取得了良好的效果，本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上將苦參堿作為凍存保護(hù)劑應(yīng)用于胎肝細(xì)胞的高數(shù)量級(jí)的凍存，觀察其效果。 目的：應(yīng)用苦參堿凍存液大規(guī)模凍存人胎肝細(xì)胞，觀察大規(guī)模低溫凍存對(duì)胎肝細(xì)胞功能的影響，為生物人工肝肝細(xì)胞庫的建立提供實(shí)驗(yàn)支持。 方法：改良肝細(xì)胞獲取方法分離人胎肝細(xì)胞，進(jìn)行40-60min預(yù)培養(yǎng)后。分別以五種不同濃度(1×107，2.5×107，5×107，7.5×107，10

5、×107)置于骨髓干細(xì)胞凍存袋凍存在液氮中，凍存一月后觀察復(fù)蘇后細(xì)胞存活率，采用秩和檢驗(yàn)得出最佳凍存濃度。用最佳凍存濃度分別將胎肝細(xì)胞凍存不同時(shí)間(1w，2w，1m，3m)后進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，采用單向方差onewayanova分析復(fù)蘇后存活率和24小時(shí)貼壁率；復(fù)蘇后進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)5d，觀察每天細(xì)胞形態(tài)變化：收集每天培養(yǎng)液上清，檢測(cè)AST、LDH、白蛋白含量并采用單向方差one-wayanova分析檢測(cè)結(jié)果；培養(yǎng)3d時(shí)檢測(cè)加氯化銨后2h、6h、

6、12h、24h上清液尿素含量并采用單向方差one-wayanova分析檢測(cè)結(jié)果。 結(jié)果：五種不同濃度的細(xì)胞凍存一月后，細(xì)胞濃度為2.5×107/ml組復(fù)蘇后存活率與其余四組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)且明顯高于其余四組。剛分離胎肝細(xì)胞存活率和24小時(shí)貼壁率明顯高于凍存不同時(shí)間(1w，2w，1m，3m)各組胎肝細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但凍存不同時(shí)間的各組之間無顯著差異(P>0.05)。整體比較未凍存組LDH

7、和AST水平明顯低于凍存不同時(shí)間各組(P<0.05)，凍存不同時(shí)間各組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但LDH水平在培養(yǎng)第四天、第五天未凍存組與凍存不同時(shí)間各組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，AST水平培養(yǎng)在第五天未凍存組與凍存不同時(shí)間各組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。整體比較白蛋白和尿素水平明顯高于凍存不同時(shí)間各組(P<0.05)，白蛋白水平在培養(yǎng)第二天、第三天未凍存組與凍存不同時(shí)間各組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0