Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號通路抑制人腦膠質瘤生長的體內研究.pdf

1、人腦膠質瘤是中樞系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，其中膠質母細胞瘤占顱內腫瘤的近50％。雖然近年來手術及術后的放療和化療取得了很大的進步，但不幸的是，其確診后的生存期仍然讓人失望，只有12-15個月。因此，新的治療膠質母細胞瘤的方法在改善預后和病人生活質量方面極需提高。到目前為止，人們普遍認為腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個多種基因參與、多環(huán)節(jié)、多階段、多步驟的復雜過程。所以僅僅干預一個腫瘤相關基因很難達到治療膠質瘤的目的。近年來，一些轉錄因子被逐漸發(fā)現(xiàn)，

2、它們在調節(jié)多個腫瘤相關基因方面起重要作用。換句話說，這些轉錄因子可以看作是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的總開關。因此，靶向性阻斷某個轉錄因子治療腫瘤越來越受到人們的關注，也逐漸成為治療膠質瘤的一個新策略。 信號傳導和轉錄活化因子3（STAT3，Signal Transducers and Activators of Transcription3）是細胞信號傳導通路JAK2/STAT3途徑的關鍵轉錄因子，存在于胞漿，參與調節(jié)胚胎發(fā)育，細胞的正常

3、生長、分化和惡變等過程。持續(xù)活化的STAT3能夠調控許多腫瘤發(fā)生的環(huán)節(jié)，包括細胞周期，凋亡，腫瘤血管形成及腫瘤細胞逃逸免疫系統(tǒng)等。因此它被看作癌基因并且實驗證實阻斷STAT3通路后可以使腫瘤細胞的增殖受到抑制，凋亡增加。這些都為STAT3作為分子靶點治療膠質瘤提供了強有力的證據。 到目前為止，已經有幾種阻斷STAT3通路的策略，包括顯性負性調節(jié)，反義核苷酸，RNA干擾技術，生化制劑，雙鏈或單鏈誘騙寡核苷酸技術。誘騙寡核苷酸技術（

4、decoy oligodeoxynucleotide，Decoy-ODN），將體外人工合成，有高度親和性，并且模擬目標轉錄因子靶基因上啟動子順式元件的序列合成的小分子“誘騙”DNA，轉染導入腫瘤細胞，競爭性地抑制靶基因啟動子與轉錄因子的結合，降低其轉錄活性，阻止這些致癌基因的轉錄激活，從而誘導凋亡，抑制腫瘤細胞增殖。由于它的高效，低成本和高特異性等優(yōu)點，誘騙寡核苷酸技術廣泛地應用于包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌和頭頸部鱗癌在內的多種腫瘤的研究

5、。結果顯示，阻斷STAT3通路后腫瘤細胞的生長顯著受到抑制并引起凋亡，然而，對膠質瘤在體內生長情況的影響卻鮮為人知。本課題旨在研究和探討應用Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號通路抑制人腦膠質瘤細胞增殖的體內效應和機制。研究內容分為三個部分。 一、人腦膠質瘤組織細胞中STAT3異常表達研究 目的: 檢測人腦膠質瘤細胞系以及臨床標本中STAT3及其磷酸化活化蛋白的表達情況，研究人腦膠質瘤中STAT3的異常表達

6、及持續(xù)活化的意義，為針對STAT3治療膠質瘤的實驗研究奠定基礎。 方法: 1、Western印跡方法檢測60例人腦膠質瘤標本和5例正常腦組織標本中STAT3及其磷酸化活化蛋白的表達，并對其異常表達及持續(xù)活化的情況進行統(tǒng)計學分析。 2、Western印跡方法檢測人腦膠質瘤細胞系U251中STAT3及其磷酸化活化蛋白的表達。 結論: 1、人腦膠質瘤組織和細胞中廣泛存在著STAT3的過高表達及持續(xù)活化，

7、說明STAT3信號傳導通路在膠質瘤中具有重要意義，為抑制STAT3治療膠質瘤的研究奠定了基礎。 2、U251細胞系中存在STAT3及其磷酸化的異常表達，可以作為本課題的研究對象。 二、Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號通路抑制人腦膠質瘤細胞增殖并促進其凋亡的體外研究 目的: 研究陽離子脂質體轉染STAT3 Decoy-ODN的效果和效率。檢測Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號通路對人腦膠質

8、瘤細胞增殖的抑制效應。檢測Decoy-ODN轉染人腦膠質瘤細胞對其凋亡的影響。 方法: 1、應用陽離子脂質體LipofectamineTM2000介導的DNA轉染法將STAT3Decoy-ODN轉染導入人腦膠質瘤細胞系U251內。 2、流式細胞術檢測FITC標記的STAT3 Decoy-ODN在U251中的轉染效率。 3、細胞計數(shù)法檢測Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號通路后對人腦膠質瘤細胞增殖的

9、抑制效應。 4、Annexin V/PI雙染法檢測Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號通路后U251細胞的凋亡情況。 結論: 1、應用陽離子脂質體LipofectamineTM2000介導的DNA轉染技術，能夠將STAT3 Decoy-ODN高效轉染入人腦膠質瘤細胞內。 2、STAT3 Decoy-ODN在體外能夠抑制人腦膠質瘤細胞增殖。 3、STAT3 Decoy-ODN在體外能夠促進人腦

10、膠質瘤細胞凋亡。 三、Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號通路抑制人腦膠質瘤細胞增殖的體內研究 目的: 評價裸鼠皮下種植U251細胞的效果，評價瘤內注射Decoy-ODN的效果，檢測在體內Decoy-ODN對人腦膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響，并對其相關基因和蛋白的表達水平進行統(tǒng)計學分析，進而深入探討在體內Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號通路抑制人腦膠質瘤細胞增殖的相關機制。 方法:

11、1、皮下注射法將U251細胞注入4周齡裸鼠右脅腹皮下。 2、觀察約一周時間，皮下瘤結節(jié)能明顯觸到后，瘤內注射Decoy-ODN并檢測其在體內對人腦膠質瘤細胞生長的影響。 3、免疫組織化學法檢測體內STAT3 Decoy-ODN作用人腦膠質瘤細胞后對增殖標志物Ki67表達水平的影響。 4、Tunel法檢測在體內Decoy-ODN對人腦膠質瘤細胞凋亡的影響。 5、RT-PCR檢測分析在體內STAT3 Deco

12、y-ODN對細胞周期控制基因和凋亡相關基因mRNA表達水平的影響。 6、免疫組織化學法檢測體內STAT3 Decoy-ODN對細胞周期控制基因和凋亡相關基因蛋白表達水平的影響。 結論: 1、U251細胞能夠在裸鼠體內成瘤。 2、STAT3 Decoy-ODN在體內能夠顯著抑制人腦膠質瘤細胞生長。 3、STAT3 Decoy-ODN在體內能夠顯著抑制人腦膠質瘤細胞增殖。 4、STAT3 De

13、coy-ODN在體內能夠顯著誘導人腦膠質瘤細胞凋亡。 5、STAT3 Decoy-ODN在體內能夠下調細胞周期和抗凋亡相關基因的表達。 6、STAT3 Decoy-ODN在體內能夠降低細胞周期和抗凋亡相關蛋白的表達。 總之，通過本研究表明，在體內應用STAT3 Decoy-ODN能夠抑制人腦膠質瘤的生長，增殖并誘導細胞凋亡。下調膠質瘤細胞中細胞周期和抗凋亡相關基因的表達，同時降低細胞周期和抗凋亡相關蛋白的表達。為