靶向特異性基因的小干擾RNA抑制膠質(zhì)瘤生長的研究.pdf

1、[目的]研究靶向胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的小干擾RNA(siRNA)對膠質(zhì)瘤生長的抑制作用；構(gòu)建靶向血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)雙基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)真核表達載體并鑒定，用于膠質(zhì)瘤基因治療。 [方法]第一、二部分：體外化學(xué)合成靶向IGF-1R和IGF-1基因的siRNA，脂質(zhì)體法將siRNA以不同濃度梯度轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤C6細胞，同時使用綠色熒光素

2、標(biāo)記的小干擾RNAFITC-siRNA轉(zhuǎn)染細胞，熒光顯微鏡下觀察siRNA轉(zhuǎn)染效率；RT-PCR和Westernblot測定RNA干擾后IGF-1R和IGF-1的表達水平：采用Transwell體外侵襲試驗進行細胞體外的侵襲力分析；流式細胞儀檢測細胞凋亡率和周期；裸鼠成瘤實驗測定IGF-1R和IGF-1基因表達下調(diào)后膠質(zhì)瘤C6細胞在裸鼠體內(nèi)致瘤能力的改變。 第三部分：分別設(shè)計并體外合成靶向基因VEGF、NGF的特異性編碼shRN

3、A序列的寡核苷酸，克隆到經(jīng)BglⅡ—HindⅢ酶切線性化的pSUPER質(zhì)粒H1啟動子下游，構(gòu)建shRNA重組質(zhì)粒，進而脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞系U251，半定量RT-PCR檢測VEGFmRNA、NGFmRNA表達。 [結(jié)果]第一部分：熒光顯微鏡下熒光素標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染組可見到細胞質(zhì)內(nèi)清晰的綠色熒光，脂質(zhì)體OligofectamineTM2000的轉(zhuǎn)染效率接近100％：靶向IGF-1R基因的siRNA可以有效抑制IGF-1

4、R基因的表達，各特異性siRNA不同濃度轉(zhuǎn)染組IGF-1RmRNA表達水平可下調(diào)約10％-80％，蛋白表達減少50％；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率轉(zhuǎn)染組為22．47％±3．15％，與陰性對照組2．3％±0．9％和空白對照組1．14％±0．79％比較有明顯提高，而陰性、空白對照組相比無明顯差異；腫瘤細胞的侵襲力明顯下降，在裸鼠體內(nèi)成瘤的能力大大降低。 第二部分：靶向IGF-1基因的siRNA可以有效抑制IGF-1基因的表達。熒光顯微鏡

5、下熒光素標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染組可見到細胞內(nèi)清晰的綠色熒光，脂質(zhì)體OligofectamineTM2000的轉(zhuǎn)染效率可達95％以上：各特異性siRNA不同濃度轉(zhuǎn)染組IGF-1mRNA表達水平可下調(diào)約40％-70％，蛋白表達減少60％，流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染IGF1-siRNA細胞凋亡率為15．07％，與對照組(1．98％)比較有明顯提高，腫瘤細胞的侵襲力明顯下降(P＜0．01)，降低了在裸鼠體內(nèi)成瘤的能力(P＜0．01)。 第三部分：