應用“decoy”技術靶向性阻斷Stat3對乳腺癌細胞系增殖抑制的研究.pdf

1、目的 乳腺癌是嚴重危害女性健康的常見惡性腫瘤之一，有報道乳腺癌已經成為全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，隨著國民經濟發(fā)展和人民生活水平提高，我國乳腺癌的發(fā)病率和死亡率都呈迅猛上升態(tài)勢，在部分城市已上升為女性惡性腫瘤的第一位。乳腺癌的主要治療手段包括手術、放療、化療和內分泌治療，這些治療手段盡管緩解了患者的痛苦，但是其療效及生存質量仍有待于提高，各國學者也在致力于探尋各種更有效的治療方法。近年來，腫瘤的基因治療研究逐漸增多，主要方向在

2、于尋找腫瘤基因治療的特異性有效靶點，從而抑制腫瘤生長，這為乳腺癌的治療開辟了一個新天地。 越來越多的研究發(fā)現，惡性腫瘤存在異?；罨男盘栟D導子和轉錄激活子(SignaltransducersandactivatorsoftranscriptionStat)，它們是潛在的細胞內轉錄因子，如果過度激活及表達可導致細胞內信號的過度放大，很可能抵抗凋亡，發(fā)生癌變。尤其是Stat3，它在細胞增殖和分化中起重要作用。在許多血液和組織癌癥中，

3、Stat3是持續(xù)激活的，Stat3的過表達使目的基因表達失調而使細胞生長失控；持續(xù)激活的Stat3上調血管內皮生長因子，誘導腫瘤血管生成，參與腫瘤免疫逃逸，抑制免疫功能。已經證實，Stat3在許多血液和實體瘤中持續(xù)激活，包括淋巴瘤、白血病、蕈樣肉芽腫、多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、頭頸癌、腦瘤、胰腺癌、卵巢癌和胃癌等，因此Stat3可以成為乳腺癌治療的新靶點。 Stat3是調節(jié)腫瘤細胞增殖的關鍵因子之一，最近分子生物學的

4、研究進展為抑制目的基因表達提供了新的技術，目前已有幾種方法用來阻斷Stat3，其中包括反義核苷酸、核酸酶、異位表達顯性失活突變體、干擾RNA、抑制上游激酶、磷酸酪氨?？s氨酸和誘騙寡核苷酸。其中，核酸酶是一類特殊的RNA分子，它不但儲存遺傳信息而且具有催化活性，催化剪切特異目的mRNA而使其降解；小干擾RNA可以與特異mRNA結合，阻斷它的翻譯而抑制目的基因表達，是一種很有潛力的治療策略。但是這些RNA分子在體內很快就降解，限制了它們的應

5、用。這樣DNA技術的應用在調節(jié)體內疾病相關基因的轉錄中具有重要的治療潛力。 轉錄因子誘騙技術是通過應用與靶轉錄因子具有高親和性的雙鏈寡聚核酸序列(即decoy-ODN)，競爭性抑制轉錄因子與調控區(qū)域的結合，調控轉錄來改變下游基因的異常表達，抑制腫瘤惡性增殖。利用decoy-ODN靶向性阻斷核轉錄因子的潛在優(yōu)勢在于①decoy-ODN序列較短，合成較為簡便、直接，較易進入胞內。②decoy-ODN具有較高特異性，能夠很容易的識別靶

6、蛋白。③避開了對靶基因在轉錄水平上復雜而又繁瑣的探究，卻又達到了理想的阻斷效果。已有報道Stat3decoy-ODN在體外和動物體內治療頭頸鱗狀上皮細胞癌和上皮癌已經顯示出其有效性，這提示誘騙策略在乳腺癌基因治療中的應用潛力。本研究以乳腺癌細胞系為研究對象，通過陽離子聚合物介導的DNA轉染技術將Stat3decoy-ODN導入乳腺癌細胞系MDA-MB-231與MCF-7后進行細胞學研究和其作用機制的探索。 方法 1.We

7、stern印跡方法檢測乳腺癌細胞系MDA-MB-231與MCF-7的Stat3總蛋白表達水平。 2.核酸-蛋白凝膠電泳遲滯實驗(EMSA)分析Stat3decoy-ODN與Stat結合能力。 3.用陽離子聚合物介導的方法將ODN轉染入乳腺癌細胞系MDA-MB-231與MCF-7后，熒光顯微鏡下觀察FITC標記的Stat3decoy-ODN在MDA-MB-231與MCF-7的定位。 4.流式細胞術檢測FITC標記的

8、Stat3decoy-ODN在MDA-MB-231與MCF-7的轉染效果。 5.細胞計數法與MTT法分析MDA-MB-231與MCF-7細胞增殖能力。 6.轉染Stat3decoy-ODN后，應用流式細胞術分析MDA-MB-231與MCF-7細胞周期。 7.RT-PCR方法分析Stat3decoy-ODN對凋亡相關基因mRNA表達水平的影響。 8.Western印跡方法分析Stat3decoy-ODN對凋

9、亡相關基因蛋白表達水平的影響。 9.FACS檢測凋亡相關基因蛋白表達水平 結果 1.Westernblot法檢測Stat3總蛋白表達水平 收集對數生長期的MDA-MB-231與MCF-7細胞，提取總蛋白，進行WesternBlot分析發(fā)現，這兩個細胞系Stat3與Phospho—Stat3(Try-705、Ser-727)的蛋白水平均有較高表達，MDA-MB-231表達水平相對較高。 2.Stat

10、3decoy-ODN與Stat結合能力 EMSA結果顯示：32P標記的Stat3decoy-ODN與MDA-MB-231與MCF-7的核蛋白抽提物孵育，在垂直凝膠電泳后掃描發(fā)現了寡核苷酸與蛋白的結合帶，而32P標記的核苷酸隨機序列(Scramble)和MDA-MB-231與MCF-7的核蛋白抽提物孵育后未出現這條結合帶。 3.熒光顯微鏡下觀察FITC標記的Stat3decoy-ODN在MDA-MB-231與MCF-7細胞

11、內的定位 MDA-MB-231與MCF-7可發(fā)現細胞核被DAPI染為藍色，大部分綠色熒光FITC標記的decoy-ODN都進入胞漿內，部分細胞核有藍綠色的疊加，說明也有decoy-ODN進入了細胞核。 4.FITC標記的Stat3decoy-ODN在MDA-MB-231與MCF-7的轉染效果的流式分析結果 在流式結果中檢測到FL1通道呈現陽性分布，并且其陽性率與Stat3decoy-ODN的濃度成正比。

12、5.Stat3decoy-ODN對細胞增殖的影響 轉染Stat3decoy-ODN后，對MDA-MB-231與MCF-7細胞進行計數，其中Decoy-ODN對細胞生長的抑制作用最為明顯，與空白對照組比較有顯著性差異，并且隨著decoy-ODN轉染濃度的升高，細胞增殖速率隨之降低；而scramble-ODN與空白對照組細胞比較差異無顯著性意義。 6.Stat3decoy-ODN對細胞周期的影響 Stat3decoy

13、-ODN轉染MDA-MB-231與MCF-7細胞24后，可見兩細胞的G1期細胞比率明顯上升，而S期比率明顯降低。 7.Stat3decoy-ODN對凋亡相關基因mRNA表達水平的影響 Stat3decoy-ODN轉染細胞后Bcl-x1，C-myc，CyclinD1mRNA表達水平顯著低于空白對照組細胞，而Scramble-ODN組細胞以上各種基因的mRNA表達水平與對照組細胞相比無明顯差異。 8.Stat3dec

14、oy-ODN對凋亡相關基因蛋白表達的Western結果 Stat3decoy-ODN轉染細胞后Bcl-x1，CyclinD1蛋白表達水平顯著低于空白對照組細胞，而Scramble-ODN組細胞以上各種基因的蛋白表達水平與對照組細胞相比無明顯差異。 9.Stat3decoy-ODN對凋亡相關基因蛋白表達的流式結果 Stat3decoy-ODN轉染細胞后應用流式胞內染色Bcl-2，發(fā)現其蛋白表達水平顯著低于空白對照組

15、細胞，而Scramble-ODN組細胞無明顯差異。 結論 本實驗應用Stat3表達陽性的MDA-MB-231與MCF-7細胞作為研究對象，通過核酸-蛋白凝膠電泳遲滯實驗(EMSA)證明Stat3decoy-ODN與Stat有較高的結合能力。通過陽離子聚合物介導的DNA轉染技術將Stat3decoy-ODN和scrambleODNs核酸對照成功的導入乳腺癌細胞系MDA-MB-231與MCF-7中，檢測結果顯示，轉染Stat

16、3decoy-ODN后MDA-MB-231細胞的增殖活性明顯低于scrambleODNS組和空白對照組細胞。進一步研究證明，Stat3decoy-ODN明顯降低細胞的S期，提示Stat3decoy-ODN能夠抑制乳腺癌細胞系的增殖，促進其凋亡STAT3調控的抗凋亡和細胞周期相關基因蛋白表達水平均在Stat3decoy-ODN組細胞明顯低于對照組細胞和Scramble組細胞，這表明了Stat3decoy-ODN并非由于本身的核苷酸毒性影響